本發明中，所述抗體爲抗CD19抗體的抗體，所述的CD19抗體包括FMC63及其衍生序列。 本發明的抗體包括重鏈和輕鏈，所述重鏈含有重鏈可變區胺基酸序列，所述輕鏈含有輕鏈可變區胺基酸序列。 在本發明中，本發明的抗體還包括其保守性變異體，指與本發明抗體的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。 脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可根據其恆定區的胺基酸序列歸爲明顯不同的兩類(稱爲κ和λ)中的一類。
結果如圖4和表7所示，MSD檢測結果顯示抗FMC63抗體可以與FMC63-scFv按照劑量依賴的方式結合，說明抗FMC63抗體可以應用到MSD方法中。 FACS檢測方法如下：將mAb與Jurkat-FMC63 scFv細胞混合，室溫培育30分鐘後DPBS洗一次，加抗鼠Fc抗體室溫培育30分鐘，DPBS洗一次後流式細胞儀上機檢測。 透過ELISA/FACS篩選免疫有反應的小鼠，取小鼠脾臟淋巴細胞與Sp2/0-Ag14細胞融合獲得雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞平盤培養至96孔培養盤中進行生長，10-14天後取上清用ELISA/FACS篩選細胞、解離速率常數，選擇高特異的亞選殖株進行擴大培養以及凍存。 在另一優選例中，所述經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸序列所形成的序列優選爲同源性或序列相同性爲至少80%，較佳地至少85%，更佳地至少爲90%，最佳地至少95%的胺基酸序列。
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所述注射給藥較佳地包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內注射或皮下注射等途徑。 所述的藥物組成物爲本領域常規的各種劑型，較佳地爲固體、半固體或液體的形式，可以爲水溶液、非水溶液或懸浮液，更佳地爲片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑或輸液劑等。 可降解的連接子典型地在細胞內環境下容易降解，例如在目標位址處連接子發生降解，從而使藥物從抗體上釋放出來。 合適的可降解的連接子包括，例如酵素降解的連接子，其中包括可以被細胞內蛋白酶(例如溶酶體蛋白酶或者胞內體蛋白酶)降解的含有肽基的連接子，或者糖連接子例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的連接子。
然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。 本發明不僅包括完整的抗體，還包括具有免疫活性的抗體的片段或抗體與其他序列形成的融合蛋白。 本發明的第十七方面，提供了一種套組，所述套組中包括： 第一容器，所述第一容器中含有本發明第五方面所述的抗體；和/或 第二容器，所述第二容器中含有抗本發明第五方面所述的抗體的二抗； 或者，所述套組含有本發明第十六方面所述的檢測盤。
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本發明的抗體與標靶CD19的CAR-T結合，從而阻斷CAR-T的功能，抑制細胞激素風暴、神經毒性和其它CAR-T相關毒副作用的發生發展。 此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。 通常，透過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。 在另一優選例中，所述的CD19抗體包括FMC63及其衍生序列，所述的衍生序列是在FMC63的胺基酸序列的基礎上，經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸獲得的序列。 然而，在體內標的細胞(癌細胞)的刺激下，CAR-T細胞才會快速增殖、釋放大量的細胞激素，從而透過細胞激素毒殺標的細胞。
根據初步的ELISA結果，D value ＞ 腫瘤放射治療2023 10，得到103個選殖株進行二次篩選。 使用ELISA和FACS方法對103個選殖株進行進一步篩選，得到23個單選殖株細胞表現結合FMC63的抗體(對應表2中的mAb01-mAb023)。 將FMC63-scFv-mFc(FMC63抗體的一條鏈)的核苷酸序列併入到真核細胞表現載體中，使用PEI將攜帶FMC63核苷酸的表現載體轉入293細胞中，使其表現FMC63蛋白，使用protein A管柱純化得到FMC63蛋白(FMC63-scFv-mFc蛋白)。 一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。 這通常是將其選殖入載體，再轉入細胞，然後透過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
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在另一優選例中，所述CD19相關疾病選自下組：癌症、自體免疫疾病、代謝相關疾病、感染疾病、或其組合。 在另一優選例中，所述檢測試劑、檢測盤或套組用於ELISA檢測、FACS檢測、電化學發光檢測、酵素連結免疫分析法。 其中在ELISA檢測中mAb06 、mAb023 親和力最優，mAb020 在FACS檢測中親和力最優。 在另一優選例中，所述經過添加、缺失、修飾和/或取代的至少一個胺基酸序列爲同源性爲至少80%的胺基酸序列。 在另一優選例中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸數量，不超過初始胺基酸序列總胺基酸數量的40%，較佳地爲20%，更佳地爲10%。 一種抗CD19抗體的抗體及其製備和應用 本發明涉及生物醫藥領域，更具體地涉及一種抗CD19抗體的抗體及其製備和應用。
所述單株抗體可以由多種途徑和技術進行研製，包括雜交瘤技術、噬菌體展示技術、單淋巴細胞基因轉殖技術等，主流是透過雜交瘤技術從野生型或基因轉殖小鼠製備單株抗體。 在本發明中，抗體包括用本領域技術人員熟知技術所製備的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗體。 重組抗體，例如嵌合的和人源化的單株抗體，包括人的和非人的部分，可以透過標準的DNA重組技術獲得，它們都是有用的抗體。 嵌合抗體是一個分子，其中不同的部分來自不同的動物種，例如具有來自鼠的單株抗體的可變區，和來自人免疫球蛋白的恆定區的嵌合抗體(見例如美國專利4,816,567和美國專利4,816,397，在此透過引用方式整體引入本文)。 腫瘤放射治療 人源化的抗體是指來源於非人物種的抗體分子，具有一個或多個來源於非人物種的互補决定區和來源於人免疫球蛋白分子的框架區域(見美國專利5,585,089，在此透過引用方式整體引入本文)。
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利用FMC63設計的CAR-T細胞藥物已經成功上市，在治療B-ALL和NHL上有較好的療效。 應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。 在另一優選例中，所述的載體包括：細菌質體、噬菌體、酵母質體、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒、或其他載體。
因此，細胞激素風暴不可片面的認定爲CAR-T的副作用，也是CAR-T在體內有效的臨床表現。 目前，在CAR-T臨床治療中，尚無法避免細胞激素風暴的產生，只能依靠密切觀察、積極應對等常規對症治療手段。 腫瘤放射治療2023 將表2所示的23種抗體加入到FMC63-CAR-T細胞，在不同時間點檢測FMC63-CAR-T細胞的密度和數量。 結果如圖6、7、8顯示，抗FMC63抗體可以促進FMC63-CAR-T細胞的增殖、活化和細胞激素釋放。
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在另一優選例中，所述的CD19高度表現的腫瘤指腫瘤組織中CD19轉錄本和/或蛋白的位準L1與正常組織中轉錄本和/或蛋白的位準L0之比，L1/L0≥2，較佳地≥3。 細胞激素風暴是指在對人體完成CAR-T輸液後，T淋巴細胞在體內被活化並快速增殖，引起了TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等細胞激素過度的級聯釋放。 這些細胞激素會媒介多種免疫反應，引起患者高燒、低血壓、肌痛、凝血障礙、呼吸困難、終末器官障礙等臨床表現，有可能對人體的組織器官造成嚴重的永久性損傷或衰竭，甚至導致死亡。
- 所述注射給藥較佳地包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內注射或皮下注射等途徑。
- 在本發明中，抗體包括用本領域技術人員熟知技術所製備的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗體。
- 一種體外檢測樣品中CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的細胞的方法，所述方法包括步驟： 在體外，將所述樣品與請求項5所述的抗體接觸； 檢測是否形成抗原-抗體複合物，其中形成複合物就表示樣品中存在CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的細胞。
- 人源化的抗體是指來源於非人物種的抗體分子，具有一個或多個來源於非人物種的互補决定區和來源於人免疫球蛋白分子的框架區域(見美國專利5,585,089，在此透過引用方式整體引入本文)。
- 一種抗CD19抗體的抗體及其製備和應用 本發明涉及生物醫藥領域，更具體地涉及一種抗CD19抗體的抗體及其製備和應用。
- 本領域技術人員可以透過使用個體基礎等上述因素和使用不超過常規的實驗來確定有效量。
功能劑(例如藥物，檢測試劑，穩定劑)被偶聯(共價連接)至抗體上。 本發明的第十六方面，提供了一種檢測盤，所述的檢測盤包括：基板(支撑盤)和測試條，所述的測試條含有本發明第五方面所述的抗體或本發明第九方面所述的免疫偶聯物。 在本發明的第五方面，提供了一種抗體，所述抗體具有： 腫瘤放射治療2023 本發明第一方面所述的重鏈可變區；和/或 本發明第三方面所述的輕鏈可變區； 腫瘤放射治療 或者，所述抗體具有：本發明第二方面所述的重鏈；和/或本發明第四方面所述的輕鏈。 CD19是簇分化抗原的一種，是B細胞增殖、分化、活化及抗體產生有關的重要膜抗原。 絕大多數的B細胞性惡性腫瘤表面都高度表現CD19，多個中心獨立開展的利用嵌合抗原受體(Chimeric 腫瘤放射治療 Antigen Receptor，CAR)修飾的T細胞標靶表現CD19的B細胞復發、難治性惡性腫瘤取得了前所未有的成功。
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不同類免疫球蛋白的次單元結構和三維構型是本領域人員所熟知的。 在本發明的第二十二方面，提供了一種雙特異性抗體，所述的雙特異性抗體包括：本發明第五方面所述抗體和第二抗體，所述的第二抗體選自下組：CD3、CD47、PD-1、PD-L1抗體，以及抗BCMA、CD20、CD22、CD33、CD123抗抗體。 本發明的第十四方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，所述的宿主細胞含有本發明第十三方面所述的載體或基因組中併入有本發明第十二方面所述的多核苷酸。 在另一優選例中，所述檢測試劑、檢測盤或套組用於： 檢測樣品中的CD19抗體；和/或 檢測免疫細胞表面的CD19抗體；和/或 檢測表現CD19抗體的免疫細胞。 本發明的單株抗體能夠高特異性地結合CD19抗體並阻斷CD19抗體的功能。
本發明的抗體可以是選自動物源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，更優選爲人源化抗體、人-動物嵌合抗體，更優選爲全人源化抗體。 在另一優選例中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸數量爲1-7個，較佳地爲1-3個，更佳地爲1個。 結果顯示，mAb06 、mAb023 在ELISA檢測中效果最優，mAb020 在FACS中檢測中效果最優。
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在本發明的第二十一方面，提供了一種製備人源化抗體的方法，包括步驟： 將本發明第一方面所述的重鏈可變區和/或本發明第三方面所述的輕鏈可變區中的CDR區的核苷酸序列植入含人源抗體FR區的核苷酸序列模板，再將其選殖入含有人抗體恆定區的表現載體後，透過轉染動物細胞表現人源化抗體。 在本發明的第二十方面，提供了一種製備嵌合抗體的方法，包括步驟： 將本發明第一方面所述的重鏈可變區和/或本發明第三方面所述的輕鏈可變區的核苷酸序列選殖入含有人抗體恆定區的核苷酸序列的表現載體後，透過轉染動物細胞表現人-鼠嵌合抗體。 在優選例中，所述的組成物是藥物組成物，它含有上述的抗體或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相應的免疫細胞，以及藥學上可接受的載劑。 腫瘤放射治療 通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載劑介質中，其中pH通常約爲5-8，較佳地pH約爲6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。 如本文所用，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。 它集中於輕鏈和重鏈可變區中稱爲互補决定區或超變區中的三個片段中。
本發明抗體或其片段的DNA分子的序列可以用常規技術，比如利用PCR擴增或基因組庫篩選等方法獲得。 所述的抗體全長蛋白爲本領域常規的抗體全長蛋白，其包括重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈恆定區和輕鏈恆定區。 腫瘤放射治療 所述的蛋白質的重鏈可變區和輕鏈可變區與人源重鏈恆定區和人源輕鏈恆定區構成全人源抗體全長蛋白。
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較佳地，所述的抗體全長蛋白爲IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。 一般，抗體的抗原結合特性可由位於重鏈和輕鏈可變區的3個特定的區域來描述，稱爲可變區域，將該段間隔成4個框架區域，4個FR的胺基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。 這些CDR形成環狀結構，透過其間的FR形成的β折疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的CDR和相應輕鏈上的CDR構成了抗體的抗原結合位址。 腫瘤放射治療2023 可以透過比較同類型的抗體的胺基酸序列來確定是哪些胺基酸構成了FR或CDR區域。
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通常，在適合本發明抗體表現的條件下，培養轉形所得的宿主細胞。 腫瘤放射治療 然後用常規的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領域技術人員熟知的常規分離純化手段純化得到本發明的抗體。 目前，已經可以完全透過化學合成來得到編碼所述的本發明的抗體(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。
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這些嵌合和人源化的單株抗體可以採用本領域熟知的DNA重組技術製備。 本發明的第十八方面，提供了一種重組多肽的製備方法，所述方法包括： 在適合表現的條件下，培養本發明第十四方面所述的宿主細胞； 從培養物中分離出重組多肽，所述的重組多肽是本發明第五方面所述的抗體或本發明第六方面所述的重組蛋白。 本發明的第六方面，提供了一種重組蛋白，所述的重組蛋白具有： 如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第二方面所述的重鏈、如本發明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、或本發明第五方面所述的抗體；以及 任選的協助表現和/或純化的標籤序列。 如本文所用，術語“抗體”或“免疫球蛋白”是有相同結構特徵的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈組成。 每條輕鏈透過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。
每條輕鏈的一端有可變區，另一端有恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。 本發明的第十九方面，提供了一種清除CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的免疫細胞的方法，所述方法包括：給需要的對象施用本發明第五方面所述的抗體、所述抗體的抗體-藥物偶聯物、或表現所述抗體的CAR-T細胞、或其組合。 其中所述重組表現載體可透過本領域常規方法獲得，即：將本發明所述的核酸分子連接於各種表現載體上建構而成。 所述的表現載體爲本領域常規的各種載體，只要其能夠容載前述核酸分子即可。 所述載體較佳地包括：各種質體、黏接質體、噬菌體或病毒載體等。 所述核酸的製備方法爲本領域常規的製備方法，較佳地，包括以下的步驟：透過基因轉殖技術獲得編碼上述蛋白質的核酸分子，或者透過人工全序列合成的方法得到編碼上述蛋白質的核酸分子。
所述的藥用載劑爲本領域常規藥用載劑，所述的藥用載劑可以爲任意合適的生理學或藥學上可接受的藥物輔料。 所述的藥物輔料爲本領域常規的藥物輔料，較佳的包括藥學上可接受的賦形劑、填充劑或稀釋劑等。 更佳地，所述的藥物組成物包括0.01～99.99%的上述蛋白質和0.01～99.99%的藥用載劑，所述百分比爲占所述藥物組成物的質量百分比。 典型地，所述抗體偶聯藥物包括所述抗體、以及效應分子，所述抗體與所述效應分子偶聯，並優選爲化學偶聯。 此外，所述效應分子可以是毒蛋白、化療藥物、小分子藥物或放射性核種中的一種或多種。
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一種體外檢測樣品中CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的細胞的方法，所述方法包括步驟： 在體外，將所述樣品與請求項5所述的抗體接觸； 檢測是否形成抗原-抗體複合物，其中形成複合物就表示樣品中存在CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的細胞。 一種在體內中和CD19抗體或中和在細胞上表現的標靶CD19的CAR的方法，所述方法包括：給需要的對象施用如請求項5所述的抗體、如請求項7所述的抗體藥物偶聯物、如請求項9所述的工程化免疫細胞、或其組合。 一種重組蛋白，其特徵在於，所述的重組蛋白具有： 如請求項1所述的重鏈可變區、如請求項2所述的重鏈、如請求項3所述的輕鏈可變區、如請求項4所述的輕鏈、或如請求項5所述的抗體；以及 任選的協助表現和/或純化的標籤序列。
