如本文所用之「生物標記」係指與特定病理學或生理學狀態相關之分子指示物。 如本文所用之「生物標記」為關於癌症之分子指示物，更特定言之為關於第II期及第III期原發性CRC之遠端轉移的指示物。 「生物標記」之實例包括(但不限於)BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242、D19S394或其組合。
- 如本文所用，短語「基本上由...組成」將申請專利範圍之範疇限制為特定材料或步驟及不實質上影響所主張發明之基本及新穎特徵的彼等材料或步驟。
- 142種基因座中之87種(61%)在大於6%的資訊性病例中展現LOH(表8)。
- 藉由訪問NCBIPubMed文獻資料庫(/pubmed)檢查所選基因與「癌症」之相關性。
- 1此等觀察結果引導本案發明人假定MSI-L及/或EMAST CRC(在該研究中稱作中等程度之MSI(MSI-M))可能屬於不同於具有MSI-H之CRC及/或具有高度穩定性微衛星(H-MSS)之CRC的臨床病理組。
- 所有公開案及專利申請案均以引用之方式併入本文中，該引用之程度就如同已特定地且個別地指示將各個公開案或專利申請案以引用之方式併入一般。
- 在MSI-M(表2)或其他CRC種類(未展示)與臨床病理學特徵(諸如年齡、性別、腫瘤級別、位置、階段及存在抑或不存在佐劑化學療法)之間未發現顯著相關性。
15對於該等基因座中之每一者，擴增來自24例展現MSI-M之LM組織與匹配正常組織的模板DNA且分析其MSI及LOH。 腫瘤級別 總而言之，吾人選擇142種具有二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸重複之基因用於篩檢。 選擇該等基因之主要準則為：1)微衛星重複位於基因之5'-UTR、外顯子、3'UTR或內含子處，2)該等重複足夠大以易受DNA聚合酶錯誤影響，及3)該等重複在長度方面為多形態的以使得可偵測LOH。
腫瘤級別: TW201300777A - 預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記
一種用於在經診斷患有原發性大腸直腸癌之患者 中選擇癌症療法之方法，該方法包含：鑑別該經診斷患有該原發性CRC之患者；確定在獲自該患者之一或多個生物樣本之細胞中一或多個單核苷酸、二核苷酸、四核苷酸重複處或其任何組合處之微衛星不穩定性程度，其中在該人類個體中，在來自該第II期或第III期CRC個體的樣本中之大部分細胞中存在MSI-M表型表示高復發風險、高肝轉移風險、降低之該癌症療法的成功可能性或其任何組合且存在H-MSS表型表示高無復發存活機率；及基於鑑別劑來選擇該癌症療法以降低或抑制該MSI-M、MSS表型。 一種用於在患有原發性大腸直腸癌之人類個體中預測無復發存活之機率、確定復發風險或用於兩者之套組，其包含：用於量測來自個體之生物樣本中四核苷酸重複處、單核苷酸或二核苷酸重複基因座(MSI-L)處之微衛星不穩定性或SMARCA2R-LOH的生物標記偵測試劑；及關於預測無復發存活之機率、確定復發風險或兩者之操作指南，其中該等操作指南包含針對在獲自患有第II期或第III期CRC之個體之生物樣本中確定MSI-M、MSI-H、H-MSS或SMARCA2R-LOH表型之存在且將其與獲自該同一個體之正常組織之生物樣本進行比較的逐步指示。 一種用於在經診斷患有原發性大腸直腸癌之患者中預測癌症療法成功機率之方法，該方法包含：鑑別該經診斷患有該原發性CRC之患者；及確定在獲自該患者之一或多個生物樣本之細胞中一或多個單核苷酸、二核苷酸、四核苷酸重複處或其任何組合處之微衛星不穩定性程度，其中在來自該第II期或第III期CRC個體的樣本中之大部分細胞中存在MSI-M表型表示高復發風險、高肝轉移風險、降低之該癌症療法的成功可能性或其任何組合。 本發明包括藉由確定大腸直腸癌患者體內四核苷酸重複處及單核苷酸與二核苷酸重複基因座(MSI-L)處之微衛星不穩定性或SMARCA2R-LOH的程度來預測無復發存活及確定大腸直腸肝轉移風險的生物標記及方法。 所獲得之結果表明第II期及第III期MSI-M患者相比具有高程度MSI(MSI-H)或具有高度穩定微衛星之剩餘患者具有較短之無復發存活，且MSI-M為原發性第II期及第III期CRC中復發性遠端轉移之獨立預測因子。
如本文中所用之術語「或其組合」係指該術語之前所列項目之所有排列及組合。 舉例而言，「A、B、C或其組合」意欲包括以下至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且若在特定情形下次序重要，則亦包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。 繼續此實例，明確地包括含有一或多個項目或術語的重複之組合，諸如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。 熟練技術人員應理解，除非自上下文顯而易見，否則一般對任何組合中之項目或術語數目均無限制。 總而言之，該等結果暗示，SMARCA2R-LOH連同與MSI-M相關之事件在LM形成中起關鍵作用。
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核酸分子可由單體構成，該等單體為天然產生之核苷酸(諸如DNA及RNA)或天然產生之核苷酸之類似物(例如，天然產生之核苷酸的α-對映異構形式)或兩者之組合。 糖修飾包括例如以鹵素、烷基、胺及疊氮基置換一或多個羥基，或糖可經官能化為醚或酯。 此外，整個糖部分可經空間及電子學上類似之結構，諸如氮雜-糖及碳環糖類似物置換。 鹼基部分中之修飾的實例包括烷基化嘌呤及嘧啶、醯化嘌呤或嘧啶或其他熟知之雜環取代基。 磷酸二酯鍵聯之類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、胺基磷酸酯及其類似物。 術語「核酸分子」亦包括所謂的「肽核酸」，其包含連接至聚醯胺主鏈之天然產生或經修飾核酸鹼基。
本案發明人確定：1)LM組織應含有肝轉移所必需之所有遺傳及/或後生變化，2)含有具有二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸重複之微衛星的基因可為誘發MSI-M之機制的標靶。 腫瘤級別 該種基因可在MSI-M陽性LM中富集，3)由於實例1中之研究顯示EMAST(MSI-M)與某些基因座處之頻繁LOH事件相關，17因此可連同MSI-M一起選擇特定基因座處之LOH。 在MSI-M陽性LM中展現高頻率LOH或MSI之基因座中，9p24.3上之SMARCA2R-LOH在LM及第IV期原發性CRC組織中與MSI-M相關，而在第II期及第III期原發性CRC組織中與此無關。 該實例顯示兩種事件(一種與MSI-M相關且另一種與SMARCA2R-LOH相關)導致癌細胞可勝任肝轉移。
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如請求項1之方法，其中存在該MSI-M與該SMARCA2R-LOH兩者表示自原發性CRC發生肝轉移。 根據本發明，可在無不當實驗之情形下製造及執行本文中所揭示及主張之所有組合物及/或方法。 儘管已根據較佳實施例描述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者將顯而易見，在不偏離本發明之概念、精神及範疇下，可對本文所述之組合物及/或方法，及該方法之步驟或步驟次序施加變化。 熟習此項技術者顯而易見之所有該等類似替代及修改均認為在如隨附申請專利範圍所定義之本發明之精神、範疇及概念內。 如本文所用，諸如(不限於)「約」、「實質」或「實質 上」之近似詞語係指如下狀況，其經如此修飾時應理解為不必絕對或完全，而應由一般技術者認為足夠接近而能確認所指定狀況存在。
16最後，當使用7種標準NCI標記及7種EMAST標記檢查同批167例原發性CRC之MSI時，識別到根據復發性遠端轉移風險不同之三組獨立的第II期及第III期CRC。 最低風險組展現MSI-H，且中等風險組展示高度穩定性微衛星(H-MSS)。 基於該等發現，吾人建議將MSI-L/EMAST定義為一組且將該組CRC命名為中等MSI(MSI-M)。 20然而，MSI-M與CRC中之復發及/或遠端轉移是如何相關仍待確定。 腫瘤級別2023 實例1表明由NCI參考標記及所選四核苷酸重複標記處升高之微衛星變化所定義之中等微衛星不穩定性(MSI-M)在原發性CRC中為常見的，且為關於第II期及第III期(II/III)原發性CRC之復發性遠端轉移的獨立預測因子。
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在另一態樣中，標記組包含BAT25、BAT26、 D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394。 在又一態樣中，第II期及第III期原發性CRC中存在MSI-M表型表示在人類個體中存在高復發性遠端轉移風險，包括肝轉移。 在另一態樣中，其中該方法用於治療患有大腸直腸癌之患者；選擇用於患有大腸直腸癌之患者的抗贅生劑療法；將患者分階層於大腸直腸癌子組中或用於大腸直腸癌療法臨床試驗；確定對大腸直腸癌治療方案之抗性或反應性；開發用於診斷大腸直腸癌之套組；或其任何組合。 在一態樣中，存在MSI-M與SMARCA2R-LOH兩者表示自原發性CRC發生肝轉移。 本發明係關於基於在大腸直腸癌組織中存在微衛 星變化(在所選四核苷酸重複處之所選升高的微衛星變化)及/或在單核苷酸與二核苷酸重複基因座(MSI-L)表型處存在低程度之微衛星不穩定性或在9p24.3上之SMARCA2區處存在異質性缺失，用於預測第II期及第III期原發性CRC之遠端轉移復發的標記及用於鑑別處於轉移復發的高風險下之患者之方法。 儘管可使用不同標記來鑑別具有缺陷型MMR之CRC，使用僅具有單核苷酸重複之標記的分析明確定義且以高準確度偵測此類型之CRC。
3,4當使用具有單核苷酸或二核苷酸重複之標記(諸如NCI參考標記)時，連同MSI-H及微衛星穩定CRC一起偵測到在二核苷酸重複處具有低MSI(MSI-L)之CRC。 2大多數MSI-H偶發性CRC已藉由啟動子超甲基化作用獲取靜默hMLH1 5且具有比MSI-L及/或MSS CRC更佳之預後。 6-8因此，MSI-H與MSI-L/MSSCRC之間之區別在遺傳學及表型方面較為明顯。 相比而言，儘管MSI-L CRC在hMSH2或hMLH1中不具有缺陷，2但MSI-L之分子基礎在很大程度上尚未可知。
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如熟習此項技術者所瞭解，該功能性術語包括染色體組序列、cDNA序列或其片段或組合，以及基因產物，包括可人工改變之彼等基因產物。 純化基因、核酸、蛋白質及其類似物用於指經鑑別且與至少一種通常締合之污染核酸或蛋白質分離之彼等實體。 術語「對偶基因」或「對偶基因形式」係指編碼相同功能性蛋白但相對於相同基因之另一形式在核苷酸序列中含有差異之替代基因形式。 如請求項11之生物標記，其中確定該等細胞中之MSI-M表型係基於包含單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸重複基因座標記之組。 142種基因座中之87種(61%)在大於6%的資訊性病例中展現LOH(表8)。 該等結果表明可經由與LOH相關之染色體不穩定性路徑在MSI-M陽性LM中產生大量遺傳變化，儘管該等腫瘤展現中等程度之MSI。
30因此，低氧可導致CRC組織中之MSH3下調，從而導致MSI-M。 由於亦已知腫瘤內低氧增強癌症侵襲性且促進原發性腫瘤組織之轉移潛能，31,32因此低氧可為經由MSH3下調誘發MSI-M且引起促進轉移之重要變化者。 為確定MSI-M與遠端轉移如何相關，鑑別與MSI-M相關及與肝轉移之能力相關之遺傳變化。 首先，選擇142種在基因內序列中含有二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸重複之候選基因(表5.1至5.3)。 腫瘤級別 針對在24例已於上述研究中發現呈MSI-M陽性之LM中高頻率之MSI或LOH篩檢該等基因。 總而言之，該等結果表明MSI-M與導致遠端轉移(包括轉移至肝)之第II期/第III期原發性CRC顯著相關。
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在與同時LM相關之第IV期原發性CRC中，高百分比之MSI-M腫瘤獲得SMARCA2R-LOH(64.3%，圖8C)。 該等結果暗示，已在腫瘤形成早期同時獲得MSI-M及SMARCA2R-LOH之CRC組織可能發展同時LM。 另一方面，在散播之後獲得SMARCA2R-LOH之MSI-M陽性CRC可能發展異時LM。 或者，在原發性組織中以微小群體存在之MSI-M及SMARCA2R-LOH雙陽性細胞若未經手術及/或化學療法去除，則可能發展異時LM。 如圖5B中所示，導致LM之原發性CRC與LM組織之MSI-M頻率無顯著變化。 當將63例匹配LM與該等LM所源自之原發性CRC的MSI狀態相比較時，此結論得到證實。
- 舉例而言，「A、B、C或其組合」意欲包括以下至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且若在特定情形下次序重要，則亦包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。
- 為確定MSI型態在散播之後是否變化，本案發明人將86例匹配LM(圖4A)與該等LM所源自之原發性CRC(圖4B)的MSI狀態相比較。
- 當發生第二次打擊SMARCA2R-LOH時，該等細胞變得勝任遠端轉移。
- 22熱變性之後，使經擴增PCR產物在ABI PRISM 3100 Avant遺傳分析器上電泳且由GeneMapper片段分析軟體進行分析。
- 如請求項1之方法，其中存在該MSI-M與該SMARCA2R-LOH兩者表示自原發性CRC發生肝轉移。
如請求項32之方法，其中該第II期及第III期原發性CRC樣本中存在該MSI-M表型可預測異時肝轉移。 如請求項23之方法，其中第II期或第III期CRC之該一或多個細胞中存在該MSI-M、EMAST/MSI-L表型表示異時肝轉移。 腫瘤級別 如請求項23之方法，其中該樣本係選自由冷凍或新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、糞便樣本、一或多種生物流體或其任何組合組成之群。
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患者及DNA分離：在Chonnam National University Hospital,Gwangju及Chonnam National University Hwasun Hospital,Chonnam,Republic of Korea，在至少5年之追蹤時段期間收集連續167例原發性CRC及匹配正常組織。 對所有患者提供書面知情同意書，且該研究得到機構審查委員會認可。 對於DNA提取，分別自經石蠟嵌埋之切片(10 μm)微剝離腫瘤及正常組織。
如所預期，16具有較大重複之基因座比具有較小重複之基因座更多地展示MSI；53%具有四核苷酸重複之基因座、15%具有三核苷酸重複之基因座及4%具有二核苷酸重複之基因座展示MSI。 如表1中所示，在MSI-M陽性LM中，RBM47(25%)、WIPF(18%)、D9S303(17%)、ZNF161(17%)、D8S1179(14%)、D21S11(13%)及KANK2(13%)在其 微衛星區域中展現較高程度之MSI。 然而，在24例LM病例中，該等基因座之突變頻率不大於7種EMAST標記之平均突變頻率(約20%)。 儘管在由PubMed搜尋之文獻中該等基因座均未與癌症相關，但仍欲確定該等基因座中之MSI是否具有任何生物功能或與MSI-M及轉移是否相關。 使用χ2測試及多重邏輯回歸分析來評估MSI-M與臨床病理因素之相關性。
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已發現，在第IV期原發性CRC及LM組織中發現SMARCA2R-LOH及MSI-M。 腫瘤級別2023 腫瘤級別2023 上文中，本案發明人表明MSI-L與EMAST兩者均可為MSH3缺乏之結果且可屬於同一CRC病理組。 20當檢查7個EMAST基因座之MSI時，約50%之非MSI-H原發性CRC展現EMAST。 16,17由標準NCI標記定義之大部分但非所有MSI-L及一半MSS展現EMAST。 16,17組織培養之大腸癌細胞中MSH3損失導致EMAST基因座處之MSI及具有二核苷酸重複之基因座處之低MSI。 腫瘤級別 16在CRC組織中偵測到MSH3表現下調與MSI-L/EMAST之間之顯著相關性。
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發現MSI狀態僅在9例匹配病例中變化(10.5%)，包括4例在散播之後MSI狀態由MSS變為MSI-M之病例及5例在散播之後MSI狀態由MSI-M變為MSS之病例(圖4C)。 該等結果表明原發性CRC之MSI狀態反映大多數病例(90%)中之轉移組織的MSI狀態(圖4D)。 本文定義之術語具有如本發明相關領域之一般技術者通常所理解之含 義。
