如本文中所使用，「重編程因子」係指一種基因、RNA、或蛋白質，其促進或促成細胞重編程，例如在體外。 所關注之用於在體外將體細胞重編程為多能性的重編程因子之實例係Oct3/4、Klf4、c-Myc、Nanog、Sox2、及Lin28、及可在重編程體細胞（例如，在體外）方法中取代這些之一或多者的任何基因/蛋白質。 「細胞培養基」（在本文中亦稱為「培養基(culture medium/medium)」或「培養物」）係用於培養細胞的培養基，其含有維持細胞活力及支持增生的營養素。 細胞培養基可含有任何呈適當組合之下列者：（多種）鹽、（多種）緩衝劑、胺基酸、葡萄糖或（多種）其他糖、抗生素、血清或血清替代品、及其他組分，諸如肽生長因子等。 副甲狀腺荷爾蒙 通常用於特定細胞類型之細胞培養基係所屬技術領域中具有通常知識者已知的。
本揭露之iPSC可用作為體外分化模型，尤其是用於研究涉及早期發育調控之基因。 使用iPSC之經分化細胞組織及器官可用於藥物研究中。 可治療或預防之疾病、病症、或病況的實例包括神經、內分泌、結構性、骨骼、血管、泌尿、消化、皮膚、血液、免疫、自體免疫、發炎、內分泌、腎、膀胱、心血管、癌症、循環、消化、造血、及肌肉疾病、病症、及病況。 此外，經重編程細胞可用於重建性應用，諸如用於修復或替換組織或器官。
接著藉由將細胞在冰箱中在4℃下再懸浮於100 µL的BD Cytofix (cat # , BD Biosciences) 30分鐘來固定細胞。 在培養期後，在室溫下將細胞以1800 rpm離心沉降5分鐘，然後再懸浮於150 µL的FACS緩衝劑中。 將1 副甲狀腺荷爾蒙2023 µL的各PCR反應產物轉移至含有Hi-Di甲醯胺及ROX或LIZ大小標準品之孔中。 副甲狀腺荷爾蒙 在第一次使用前，依照製造商的說明將洗滌溶液濃縮物用乙醇稀釋。
在一替代性實施例中，外源引入之多能性基因可暫時轉染至細胞中，個別地或作為cDNA表現庫（製備自多能細胞）之一部分。 此類多能細胞可係胚胎幹細胞、卵母細胞、囊胚細胞、內細胞團細胞、胚胎生殖細胞、類胚體（胚）細胞、桑椹胚衍生細胞、畸胎瘤（畸形癌）細胞、及在胚胎發育過程後期取得之多潛能經部分分化胚胎幹細胞。 在某些實施例中，其中經單離細胞群係在活化培養物中培養不長於一段特定時間。 例如，經單離細胞群係在活化培養物中培養至多13天、至多12天、至多11天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天、至多4天、至多3天、至多2天、或至多1天。 在一具體實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養至多5天。
在某些實施例中，該方法進一步包含向對象投予經分化之細胞。 在某些實施例中，該方法進一步包含單離及/或純化所生產之iPSC。 在某些實施例中，該方法進一步包含向對象投予經單離之iPSC。 在某些實施例中，在步驟中γδ T細胞之至少一部分經活化為Vγ9 +γδ T細胞。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養至多13天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天、至多4天、至多3天、至多2天、或至多1天。
在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含25%至35% 副甲狀腺荷爾蒙2023 γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含30%至35% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至30% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至25% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至20% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至15% γδ T細胞。
在所執行之基因組PCT分析中，來自群落A、B、及C之iPSC群落全都顯示TRG及TRD基因之重排。 基因重排係識別為代表Vγ9-JP及Vδ2-Jδ1或Jδ3重組之單帶，其指示這些群落帶有經重排Vγ9Vδ2-TCR基因。 針對所有三個群落，偵測到TRG基因之重排為代表Vγ9-JP之單帶。
在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含5%至40% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含5%至35% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含15%至35% γδ 副甲狀腺荷爾蒙 T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含25%至35% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含30%至35% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含5%至30% 副甲狀腺荷爾蒙 γδ T細胞。
Bcl-2表現可能如何用於在供體細胞轉染後抑制相關細胞譜系之細胞凋亡的深入討論係揭示於美國專利第5,646,008號中，其以引用方式併入本文中。 本揭露亦關於將屬於多能性相關基因之內源基因座引入經活化細胞群中。 副甲狀腺荷爾蒙2023 在一些實施例中，此類多能性相關基因可使用表現載體引入。 副甲狀腺荷爾蒙2023 在一些實施例中，此類多能性相關基因可使用具有至少一個靶向所欲基因座之sgRNA的CRISPR活化系統引入。
此類細胞可係胚胎幹細胞、卵母細胞、囊胚細胞、畸形癌、胚胎生殖細胞、內細胞團細胞等。 媒劑可含有其他醫藥上可接受之賦形劑以修改或維持醫藥組成物之pH、滲透性、黏度、或穩定性。 在某些實施例中，經單離iPSC群的基因組係穩定的且無染色體損失。 在一個實施例中，經單離iPSC群的基因組穩定性係藉由核型分析判定。
將含有StemFit Basic2.0（基於滋養細胞之培養）或mTeSR（無滋養細胞）之培養基取至倒置顯微鏡（OLYMPUS，型號CKX53SF，S.no 8M44621）以進行群落拾取。 重要的是確保在將顯微鏡移至層流櫃中前，顯微鏡係乾淨的且經過消毒。 調整顯微鏡以對焦在預先標記的群落上，使用安裝於200 µL吸量管上具有加長口部的凝膠加載吸管尖來回刮削。 副甲狀腺荷爾蒙 將細胞-細胞團塊（或母細胞）用編碼OCT3/4、SOX2、KLF4、及c-Myc重編程因子之仙台病毒載體轉導。 使經SeV載體轉導之細胞在有絲分裂去活化之MEF滋養層、T細胞耗竭之自體PBMC、及/或無滋養細胞條件上繁殖，如以下於第7.2.1節至第7.2.5節中所述。 在一些實施例中，本文中所提供之篩選方法係用於識別在將細胞重編程為多能狀態時取代Klf4之試劑或試劑組合。
代表性峰顯示來自群落A、B、C、D、及E之基因組PCR的擴增子大小（以鹼基對計）。 〔 圖4 〕顯示iPSC群落中之TRG及TRD基因座基因重排的評估。 代表性瓊脂糖凝膠影像顯示由Vγ9或Vδ2正向引子結合各種連接區引子所介導之來自群落A、B、及C的基因組DNA之擴增。
前峰有時會偏斜且在右側具有朝向真正的峰傾斜的底部。 這在樣品對照組大小標準液預混液中特別明顯，其中96-bp峰在84 bp處具有前峰。 使用GenElute™哺乳動物基因組DNA小量製備套組(cat # G1N70-1Kt, Sigma)，將來自iPSC群落及22Rv1細胞之基因組DNA單離出來，如以下規程中所詳細描述。 受損的群落可能要更久（7至10天）才會回復。
- 如實施例D1至D15中任一者之方法，其中該等γδ T細胞之至少一部分經活化為Vγ9δ2 +γδ T細胞。
- 經分化細胞或經誘導分化之細胞係佔據細胞譜系內較高特化（「定向」）位置之細胞。
- 在某些實施例中，細胞係維持於培養物中1至9天。
- 如實施例A1至A3中任一者之方法，其中該方法進一步包含自對象獲得該經單離細胞群。
- 繼代間隔取決於iPSC群落之生長，其可能隨供體而有所變化。
因此，其將會消除與目前移植方法相關聯之顯著問題，即經移植組織之排斥，此可能會因為宿主對移植物或移植物對宿主之排斥而發生。 傳統上，排斥係藉由投予抗排斥藥物（諸如環孢素）來預防或減少。 然而，此類藥物具有明顯的不良副作用（例如，免疫抑制、致癌性質），且非常昂貴。 本發明應會消除（或至少大幅減少）對於抗排斥藥物（諸如環孢素、移護寧、FK-506、糖皮質素、及雷帕黴素、及其衍生物）之需要。 副甲狀腺荷爾蒙2023 醫藥組成物一般包含治療有效量的至少一種所生產之iPSC或自其分化之細胞、及醫藥上可接受之載劑。 合適的醫藥上可接受之載劑包括但不限於抗氧化劑（例如，抗壞血酸）、保存劑（例如，苯甲醇、對羥苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸酯）、乳化劑、懸浮劑、分散劑、溶劑、緩衝劑、潤滑劑、填料、及/或稀釋劑。
