除了使得载体能够转运到目的位点，本发明的载体也确保了转基因的表达和持续。 副甲状腺癌2023 如权利要求21所述的缀合物，其特征在于所述放射性诊断成分包含氟-18，锝-99，钼-99，铷-82，锶-82，铊-201，或它们的组合物。 如权利要求12所述的缀合物，其特征在于所述诊断成分包含放射性诊断成分，荧光成分，量子点，或它们的组合物。
也有可能是缺失了这段序列，导致了第二个Cys的缺失，从而影响了这个结构域的空间结构成环。 因为依据计算机模建的结果，第二个Cys和第三个Cys之间是不太可能形成一个环状结构的，可能的原因是两个Cys之间紧靠有一段putatively形成α-螺旋结构的序列，造成两者间二硫键形成的困难。 图9a_b中显示了在Ad5-DM-GM_CSF治疗之前和之后，患有卵巢癌的患者和患有间皮瘤的患者（见表1)的CT扫描。 使用提取自Ad5/3-DM-Cox2L(lX vp/ml)在正常人血清中的系列稀释液的 DNA来生成回归标准曲线。 对于所述检测而言，检测的极限和定量的极限是500vp/ml血清。 在相同的PCR操作（PCR run)中使用TaqMan外源性内部阳性对照试剂（Applied Biosystems)来就PCR抑制剂的存在测试各样品。
副甲状腺癌: 副甲状腺がんはどんな病気ですか
通常，当本发明组合物用于上述用途时，所述融合蛋白可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药物剂型，如片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末、栓剂等。 通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的所述融合蛋白较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。 副甲状腺癌 含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。 用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3',5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。 然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起保温。
在每个正常人体细胞的表面的EGFR的数量通常为4×104到1×105左右，而每个肿瘤细胞表面的EGFR则超过2×106，是正常细胞的20-50倍2。 由于EGFR介导的信号转导在肿瘤细胞的增殖、损伤修复、侵袭及新生血管形成等方面起重要作用，因此EGFR自然就成为了肿瘤诊断和治疗中特别关注的关键靶位点，成为肿瘤药物开发和临床治疗应用的一个重要方向3。 一种肿瘤靶向多肽、制备方法及其应用，肿瘤靶向多肽专一性结合能力更好，从而减轻肿瘤治疗药物对正常细胞的影响，降低药物不良反应的发生，提高治疗效果。 38.根据权利要求37的溶瘤性腺病毒载体的用途，其中靶细胞或组织中天然杀伤细胞和/或细胞毒性T细胞的量增加了。 15.根据前述权利要求中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其中所述载体能够在Rb通路中有缺陷的细胞中选择性地复制。
副甲状腺癌: WO2018165867A1 - 肿瘤靶向多肽、制备方法及其应用
在本发明的优选实施方式中，Ad 5载体的所有其它区域都是野生型的。 在本发明的优选实施方式中，野生型区域位于El区的上游。 在本发明的优选实施方式中，编码GM-CSF的核酸序列是野生型的。 如本申请中所用的，表述“腺病毒血清型5仏肪）核酸骨架”指Ad5的基因组或部分基因组，其包含选自下列的一个或数个区域：Ad5起源的部分El、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、 L1、L2、L 3、L4、部分E3、L5和E4。 在另一个优选的载体中，腺病毒核酸骨架大部分源自Ad5并且结合了 Ad3的一部分（例如，衣壳结构的一部分）。
所述标记包括对真核细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。 适当宿主的代表性例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CHO,COS,NSO,293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。 副甲状腺癌2023 本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明的肿瘤靶向肽”或肿瘤细胞靶向性穿膜肽或含其的融合蛋白的方法。
副甲状腺癌: 副甲状腺腫瘍とは
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。 所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis等,Basic Methods In Molecular Biology。 在一些实施方式中，所述包含放射性治疗成分，放射性核酸，毒素，治疗成分，或化学治疗成分，或它们的组合。 副甲状腺癌 在一些实施方式中，所述化学治疗成分包含卡培他滨,顺铂,曲妥珠单抗,氟维司群,它莫西芬,来曲唑,依西美坦,阿那曲唑,氨鲁米特,睾内酯,伏氯唑,福美坦,法倔唑,来曲唑,埃罗替尼,阿法替尼,达沙替尼,吉非替尼,伊马替尼,pazopinib,拉帕替尼,舒尼替尼,尼罗替尼,索拉非尼,nab-紫杉醇(nab-palitaxel)，或衍生物或它们的组合物。 在一些实施方式中，所述放射性治疗成分包含放射性同位素，所示放射性同位素为碘-131，镥-177，钇-90，钐-153，磷-32，铯-131，钯-103，镭-223，碘-125，硼-10，锕-225，铋-213，镭-225，铅-212，钍-232，或它们的组合。
此外，所述组合物可包含至少两种、三种或四种不同的本发明的载体。 除了本发明的载体之外，药物组合物还可包含任何其它的载体（例如其它的腺病毒载体）、其它治疗上有效的试剂、任何其它的试剂，例如药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、杀菌剂、填料、稳定剂或增稠剂、和/或任何通常在相应产品中被发现的化合物。 图8d显示了通过Ad5-DM-GMCSF诱导肿瘤特异性免疫应答，用Ad5-DM_GMCSF治愈HapTl肿瘤没有保护叙利亚仓鼠免患Hak肿瘤。 副甲状腺癌 用不同的肿瘤再攻击之前用Ad5DM或 Ad5D24-GMCSF治疗过的具有HapTl肿瘤的动物（图8a)，并且随时间测量肿瘤的生长。
副甲状腺癌: 副甲状腺癌の原因
图fe显示了 Ad5-DM_GMCSF在带有胰腺癌肿瘤的叙利亚仓鼠（允许人腺病毒复制）中的体内效力。 Ad5DM和Ad5-DM-GMCSF均在治疗后的16天内清除肿瘤。 图6b显示了腺病毒表达的GMCSF在人淋巴细胞中保持其生物学活性。
在过去的几十年中已经开发了病毒载体的所有这些特性并且在生物医学中广泛地研究了例如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。 如权利要求12所述的缀合物，其特征在于所述治疗成分包含放射性治疗成分，化学治疗成分，抗体，酶，或它们的组合。 一种肿瘤靶向多肽，其包含氨基酸序列为YXGXR所示的第一序列和氨基酸序列为YXGXR所示的另一第二序列，所述第一序列与所述第二序列之间通过连接肽链接，其中Y表示酪氨酸或其衍生物；G表示甘氨酸或其衍生物；R表示精氨酸或其衍生物；X表示含侧链带脂肪类基团或/和羟基类基团或它们组合或其衍生物的氨基酸。 MAP30同样也是一种具有抗肿瘤活性的蛋白药物，其来自于苦瓜种子，也是一种RIP蛋白。 将其与ELBD-H2融合表达后，MAP30-ELBD-H2对肿瘤细胞HeLa、B16细胞的抑制率显著提高，然而对正常细胞MRC-5的抑制率没有显著提高(图8)。
副甲状腺癌: 副甲状腺がんの治療(PDQ®)
与野生型的腺病毒基因组相比，本发明的腺病毒载体在El区（特别是在ElA区） 的CR2中缺少M个碱基对，以及在E 3区缺少gpWk和6. 在本发明的优选实施方式中，除了部分的El和E 3区外，本发明的溶瘤性腺病毒载体还包含选自E2，E4，和晚期区域的一个或多个区域；在本发明的优选实施方式中，所述溶瘤性腺病毒载体包含下列区域： 左 ITR、部分 El、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、Li、L2、L3、L4、部分 E3、L5、E4 和右 ITR。 在所述载体中，所述区域可以以任何顺序，但是在本发明的优选实施方式中，所述区域按照顺次顺序在5'至3'的方向上。
- “钙通道阻断剂”指一类药物和天然物质，其破坏钙通道的传导，并且其可以选自：维拉帕米、二氢吡啶类、加洛帕米、地尔硫卓、咪拉地尔、苄普地尔、氟司必林和芬地林。
- 图7c显示了通过在归档的肿瘤样品中对Ad5-D25_GMCSF的受体CAR(柯萨奇-腺病毒受体）进行染色，而对Ad5-D25-GMCSF转导肿瘤的预测。
- 和大多数镍螯合亲和层析纯化目标蛋白的方法类似，采用带有不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱(20mM咪唑洗脱、50mM咪唑洗脱、200mM咪唑洗脱)，收集不同浓度咪唑洗脱下的目标蛋白组分。
- 为了追踪或研究本发明的效果，可测定各种免疫应答的标志物（例如，发炎的标志物）。
- 结合Table 1的序列和激光共聚焦、流式细胞术实验所得的穿膜效率(图2)可以看出，putative成环的Cys位置和数量对穿膜结果有确切的影响作用。
“诱导自我吞噬的试剂”指能够诱导自我吞噬的试剂，并且可选自但不限于：mT0R抑制剂、PUK抑制剂、锂、他莫昔芬、氯喹、洛霉素（bafilomycin)、特癌适（temsirolimus)、西罗莫司和替莫唑胺。在本发明的特定实施方式中，所述方法还包括向受试者施用替莫唑胺。替莫唑胺可以是口服的或静脉内的替莫唑胺。 在于细胞中生产GM-CSF的方法中，将包含本发明的载体的媒介运送至细胞内，并且表达GM-CSF基因，且蛋白质被翻译并以旁分泌的方式被分泌。 “媒介”可以是能够将本发明的载体递送至靶细胞的任何病毒载体、质粒或其它工具（例如颗粒）。 可使用本领域已知的任何常规的方法来将载体递送至细胞。
副甲状腺癌: 患者さんの手記
例如，对肽链末端的修饰方法有N端的乙酰化和C末端的酰胺化修饰，从而对末端的氨基或羧基进行保护。 副甲状腺癌 副甲状腺癌 PEG分子或者是进行糖基化修饰，从而增加多肽分子的相对分子量和空间位阻，提高其对多肽水解酶的稳定性，延长在体内循环系统的滞留时间。 同时也可以通过替换个别易酶解的氨基酸残基，或者是将L-型氨基酸替换为D-型氨基酸来延长或改善多肽药物的半衰期。
然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。 另一方面，本发明公开了本发明所述肿瘤靶向多肽的制备方法，其包含培养本发明所述宿主细胞，制备所述肿瘤靶向多肽。 在一些实施方式中，所述肿瘤靶向多肽为氨基酸序列为SEQ ID NO.1-4或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9中之一的多肽或其修饰衍生物；优选为如氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9的多肽。 在一些实施方式中，所述连接肽包含形成α-螺旋的氨基酸序列，优选为所述连接肽包含刚性α-螺旋的结构，更优选所述连接肽包含氨基酸序列为HMAATT的序列。 背景技术 肿瘤是当今世界严重影响人类健康和生命的三大疾病之一。 在许多常见的肿瘤疾病中，如乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、表皮鳞癌、肾癌、头颈部恶性肿瘤、恶性胶质瘤等，往往都存在肿瘤细胞表面表皮生长因子受体异常过度表达的现象1，并且EGFR的高表达常常与细胞增殖活动异常密切相关。
副甲状腺癌: 患者様へ病気と治療
7K外而含有所有腺病毒基因的Ad5/3-DM_GMCSF 质粒（pAdOT24. GM-CSF)。 图3显示了克隆的第二步的图示，以产生含有所有腺病毒基因并带有El区中的M个碱基对缺失（其介导癌细胞中的选择性复制）的质粒。 结合Table 1的序列和激光共聚焦、流式细胞术实验所得的穿膜效率(图2)可以看出，putative成环的Cys位置和数量对穿膜结果有确切的影响作用。 序列V16-9，V16-3，V16-2， 和V16-1的穿膜效果都低于ELBD。 与V16-3，V16-2相比，V16-1的效果更差，其与V16-9相当。
为了检查肿瘤可以被基于Ad5的病毒感染，将取自组织的活体样本均质化并根据标准的感染方案用编码荧光素酶的Ad5Lucl使其感染。 简要地，用PBS将接种于孔中的细胞清洗两次，融化病毒并重悬于最少量的生长培养基中且轻轻地倒在细胞上。 感染进行了 30分钟，随后在PBS中再次清洗细胞并加入适量的完全生长培养基。 需注意仅获得了少量的组织，因此不能计算细胞的数目，也不能计算相对于组织的量校准过的病毒量。
副甲状腺癌: 副甲状腺について
如权利要求15所述的缀合物，其特征在于所述细胞穿膜肽为SEQ ID 副甲状腺癌 NO.12氨基酸序列所示的多肽，来自HIV的反式激活蛋白TAT的氨基酸片段，EC-SOD来源的肝素结合域的氨基酸片段，HBEGF来源的肝素结合域的氨基酸片段，或它们的衍生物。 为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签多肽。 副甲状腺癌 常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、六聚组氨酸肽(His.Tag)、蛋白质A和纤维素结合位点等。 通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。 如His.Tag与Ni-Chelating Sepharose柱特异性结合。 所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和Xa因子等，以获得目标蛋白。
副甲状腺癌: 副甲状腺腫瘍の
在第4天对用或Ad5-DM_GMCSF处理的动物进行取样并通过FACSARRAY 评估血清中人GMCSF的浓度。 ②取此菌体培养液，以1％的接种量接入一定体积含一定浓度卡那霉素(10-50mg/L)的培养基中继续进行扩大培养，直至OD600约为0.5-1.0。 采用人工固相合成带有Bam HI和Xho 副甲状腺癌2023 副甲状腺癌2023 I酶切位点的DNA引物，以已构建的质粒EGFP-ELBD-H2-pET28a中的ELBD-H2基因为模板进行PCR扩增，并添加酶切位点Bam HI和Xho I。
