制剂可选自（但不限于）：溶液、乳剂、悬浮液、片剂、丸剂和胶囊。 表 5 中报导了根据 RECIST 标准(Therasse P 等人 2000，J NatlCancer Inst 92， )对Ad5-DM-GM-CSF效力的评价。 有趣地，在14位可分析的患者中，观察到了两例完全应答（CR)和五例稳定的疾病（SD)，给出50%的临床获益率。
7.根据前述权利要求中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其中编码GM-CSF的核酸序列在病毒E 3启动子的控制之下。 除了客观地测量抗肿瘤活性之外，我们还在数例中见到了临床的和/或主观的益处（表9)。这些包括患者的整体健康改善了，明显感到肿瘤更柔软了和/或更小了以及由肿瘤引起的症状得到了缓解。重要的是，两名之前遭受腹水和/或胸腔积液快速积聚的患者，在病毒治疗后具有所述积聚的清楚的减少，此效果在两例中均持续了数月。 在用Ad5/3-d24-GMCSF治疗前，所有的患者对于Ad5/3-d24_GMCSF都是阴性的。 在第1天，17/19患者在血清中具有可测量水平的病毒基因组，最高的滴度为2061VP/ml血清。 副甲状腺癌 从在第3-7天中所取的样品来看，12/15名患者是阳性的，最高的滴度是3，36xl05vp/ml血清。 总之，数据显示了 Ad5-DM-GM_CSF在免疫活性的携带肿瘤的动物中具有抗肿瘤活性，并且其能够引起肿瘤特异性的免疫性，以至排斥相同肿瘤的随后攻击的程度。
副甲状腺癌: 分子標的薬治療
在第4天对用或Ad5-DM_GMCSF处理的动物进行取样并通过FACSARRAY 评估血清中人GMCSF的浓度。 ②取此菌体培养液，以1％的接种量接入一定体积含一定浓度卡那霉素(10-50mg/L)的培养基中继续进行扩大培养，直至OD600约为0.5-1.0。 采用人工固相合成带有Bam HI和Xho I酶切位点的DNA引物，以已构建的质粒EGFP-ELBD-H2-pET28a中的ELBD-H2基因为模板进行PCR扩增，并添加酶切位点Bam HI和Xho I。 转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA，送DNA序列测序公司测序验证。 上述剂型中可用于注射途径给药的剂型包括：注射剂、注射用无菌粉末，它们是将药物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合制成以供注射给药的形式。 此外，还需加入抑菌剂(如苯甲醇、羟苯丁酯、硫柳汞)、 等渗调节剂(如氯化钠、葡萄糖)、助悬剂(如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素)、增溶剂(吐温-80、卵磷酯)、抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠)和填充剂(如乳糖、甘露醇)。
在本发明中可使用改善病毒向肿瘤细胞的递送的任何衣壳修饰（即本领域已知的对六邻体、纤毛和/或五邻体基质蛋白的修饰）。 在本发明的优选实施方式中， 所述衣壳修饰是Ad5/3嵌合体，将整联蛋白结合（RGD)区和/或结合硫酸肝素的聚赖氨酸修饰插入纤毛中。在本发明的特定实施方式中，所述衣壳修饰是Ad5/3嵌合体。 使用外源的组织或肿瘤特异性启动子在重组腺病毒载体中是常见的并且它们也可被用于本发明中。 例如，可通过例如启动子将病毒复制限制在靶细胞中，所述启动子包括但不限于CEA，SLP，Cox-2，肝素结合细胞因子，hTERT，hTERT的变体，E2F，E2F的变体，CXCR4，SCCA2和TTS。 通常它们被加入以控制ElA区域，但是此外或备选地，其它基因（例如ElB或E4)也可被调节。重组腺病毒载体中也可包括外源性的绝缘子（即对抗非特异性增强子的阻碍元件）、左I 副甲状腺癌 副甲状腺癌2023 TR、天然ElA启动子或染色质蛋白。
副甲状腺癌: 甲状腺がん 患者数（がん統計）
在存在人重组GMCSF(大肠杆菌生产的，购自Sigma)或存在来自经Ad5-DM_GMCSF感染的细胞的上清液时培养需要人GMCSF而存活的TFl细胞。 本发明的目的是提供用于实现腺病毒的上述特性的新的方法和手段，并从而解决常规癌症疗法的问题。 权利要求30所述的药物组合物，其特征在于其还包含放射性治疗成分，放射性核素，毒素，治疗成分，化学治疗成分，或它们的组合。 如权利要求18所述的缀合物，其特征在于所述放射性治疗成分包含放射性同位素，所示放射性同位素为碘-131，镥-177，钇-90，钐-153，磷-32，铯-131，钯-103，镭-223，碘-125，硼-10，锕-225，铋-213，镭-225，铅-212，钍-232，或它们的组合。 如权利要求15所述的缀合物，其特征在于所述缀合物包含氨基酸序列为SEQ ID NO.13-15中之一的多肽。
任选地，可使用任何其它的组分或修饰但在本发明的载体中不是必须的。 本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。 可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。 在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。 另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。
副甲状腺癌: 副甲状腺癌の診断
其中对于V16，被特别命名为ELBD，构建的相应的表达载体为EGFP-ELBD-HBD-pET28a。 “药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。 “药学上可接受的载体”是用于将本发明的融合体蛋白传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。 在一些实施方式中，所述诊断成分包含放射性诊断成分，荧光成分，量子点，或它们的组合物，其中所述放射性诊断成分包含氟-18，锝-99，钼-99，铷-82，锶-82，铊-201，或它们的组合物。 在一些实施方式中，所述连接肽包含6个以上的氨基酸残基；或所述连接肽包含少于3个氨基酸残基；或所述连接肽由1个氨基酸残基组成；所述连接肽由组氨酸或其衍生物组成。
在一些实施方式中，所述包含放射性治疗成分，放射性核酸，毒素，治疗成分，或化学治疗成分，或它们的组合。 在一些实施方式中，所述化学治疗成分包含卡培他滨,顺铂,曲妥珠单抗,氟维司群,它莫西芬,来曲唑,依西美坦,阿那曲唑,氨鲁米特,睾内酯,伏氯唑,福美坦,法倔唑,来曲唑,埃罗替尼,阿法替尼,达沙替尼,吉非替尼,伊马替尼,pazopinib,拉帕替尼,舒尼替尼,尼罗替尼,索拉非尼,nab-紫杉醇(nab-palitaxel)，或衍生物或它们的组合物。 副甲状腺癌2023 在一些实施方式中，所述放射性治疗成分包含放射性同位素，所示放射性同位素为碘-131，镥-177，钇-90，钐-153，磷-32，铯-131，钯-103，镭-223，碘-125，硼-10，锕-225，铋-213，镭-225，铅-212，钍-232，或它们的组合。 在一些实施方式中，所述连接器包含共价键连接或非共价键连接，优选所述共价键连接包含直接共价键，肽键，酯键，二硫键，酰胺键，酰亚胺键，磷酸二酯键，脲键，异氰酸酯键，或它们的组合。 副甲状腺癌2023 23.根据权利要求19-22中任一项的用途或方法，其中所述施用是通过肿瘤内、肌内、 动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、腔内或腹膜注射进行的，或者是口服施用。 通过超声引导的肿瘤内注射施用病毒，而大约五分之一的剂量被静脉内施与。
副甲状腺癌: 患者さん向け
“肿瘤细胞靶向性穿膜肽”为是指一类短肽序列，含有具有细胞穿膜肽活性的CPPs结构域和上述“肿瘤靶向肽”。 在一些实施方式中，所述肿瘤靶向多肽可特异性结合EGFR家族任一成员，优选所述肿瘤靶向多肽可以与EGFR结合，其Kd小于50nM。 29.根据权利要求19-28中任一项的用途或方法，其中所述方法还包括向受试者施用诱导自我吞噬的试剂。 28.根据权利要求19-27中任一项的用途或方法，其中所述方法还包括向受试者施用维拉帕米或另一种钙通道阻断剂。
- 其可作为静脉内推注剂量或低剂量的口服不间断施用而被使用。
- 单独的病毒复制虽然是免疫原性的，但是通常不足以诱导有效的抗肿瘤免疫性。
- 本发明的溶瘤性腺病毒载体是基于腺病毒血清型5仏肪）核酸骨架、在腺病毒El的Rb结合恒定区2中的Mbp的缺失（DM)、和替代腺病毒E 3区中缺失的 gpl9k/6. 7K的编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)的核酸序列的（图1)。在本发明的优选实施方式中，所述腺病毒载体是基于人腺病毒的。
- 此外，本发明为选择性治疗提供了工具和方法，而在健康组织中没有毒性或损伤。
- 在一些实施方式中，所述放射性治疗成分包含放射性同位素，所示放射性同位素为碘-131，镥-177，钇-90，钐-153，磷-32，铯-131，钯-103，镭-223，碘-125，硼-10，锕-225，铋-213，镭-225，铅-212，钍-232，或它们的组合。
- “抗CD20治疗”指能够杀死CD20阳性细胞的试剂，可选自利妥昔单抗和其它抗CD20单克隆抗体。
在本发明的一个实施方式中，所述方法或用途还包括施用化学疗法或抗CD20治疗或其它阻断中和抗体的方法。 “抗CD20治疗”指能够杀死CD20阳性细胞的试剂，可选自利妥昔单抗和其它抗CD20单克隆抗体。 “阻断中和抗体的方法”指能够抑制通常由感染产生的抗病毒抗体的生成的试剂，可选自：不同的化疗剂、免疫调节性物质、肾上腺皮质素和其它药物。 这些物质可选自但不局限于：环磷酰胺、环孢菌素、咪唑硫嘌呤、甲基强的松龙、依托泊甙、CD40L、CTLA4I g4、FK506 (他克莫司）、IL-12、IFN- γ、白细胞介素10、抗⑶8、抗⑶4抗体、脊髓抑制（myeloablation)和口服腺病毒蛋白质。 为了避免受试者中的中和抗体，本发明的载体在治疗之间可变化。
副甲状腺癌: 副甲状腺機能亢進症顎腫瘍症候群（Hyperparathyroidism-jaw tumor syndrome：HPT-JT症候群）
如权利要求12所述的缀合物，其特征在于所述诊断成分包含放射性诊断成分，荧光成分，量子点，或它们的组合物。 将TCS的基因序列与ELBD突变体核苷酸序列以及H2穿膜肽序列融合表达后，其TCS-ELBD-H2对B16(鼠黑色素瘤细胞)的抑制率显著提高(图7)。 副甲状腺癌 选用11种细胞来研究EGFP-ELBD-HBD重组蛋白的肿瘤靶向性特征。 其中包括9种人体肿瘤细胞：HeLa(人宫颈癌细胞)、Bcap(人乳腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)，A357(人恶性黑素瘤)，T24(人膀胱癌细胞)，MGC-803(人胃癌细胞)，95D(人巨细胞肺癌细胞)，BxPC-3(人胰腺癌细胞)，5637(人膀胱癌细胞)，以及2种正常人体细胞：MRC-5(人胚肺成纤维细胞)，293T(人肾上皮细胞)。 ⑤收集的上清液经过镍螯合亲和层析柱进行亲和层析分离。 和大多数镍螯合亲和层析纯化目标蛋白的方法类似，采用带有不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱(20mM咪唑洗脱、50mM咪唑洗脱、200mM咪唑洗脱)，收集不同浓度咪唑洗脱下的目标蛋白组分。
34.在细胞中生产GM-CSF的方法，其中所述方法包括：a)将包含根据权利要求1-15中任一项的溶瘤性腺病毒载体的媒介运送至细胞，和b)在所述细胞中表达所述载体的GM-CSF。 本发明的载体和药物组合物可被施用于任何真核受试者，所述真核受试者选自： 植物、动物和人类。 此外，所述组合物可包含至少两种、三种或四种不同的本发明的载体。 除了本发明的载体之外，药物组合物还可包含任何其它的载体（例如其它的腺病毒载体）、其它治疗上有效的试剂、任何其它的试剂，例如药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、杀菌剂、填料、稳定剂或增稠剂、和/或任何通常在相应产品中被发现的化合物。 图8d显示了通过Ad5-DM-GMCSF诱导肿瘤特异性免疫应答，用Ad5-DM_GMCSF治愈HapTl肿瘤没有保护叙利亚仓鼠免患Hak肿瘤。
副甲状腺癌: 副甲状腺腫瘍の
此“0期”同情使用项目在HUCH外科伦理委员会得到了讨论。 具有晚期的和难以治疗的实体肿瘤的患者参加了政府批准的同情 治疗方案。 接受Ad5-DM-GM_CSF的患者的信息在表1中列出。 如在本申请中所使用的，衣壳的“Ad5/3嵌合体”指嵌合体，其中纤毛的节部分来自 Ad血清型3而纤毛的其余部分来自Ad血清型5。 如在本申请中所使用的，表述“病毒包装信号“指病毒DNA的一部分，其由一系列富含AT的序列组成并且控制衣壳化过程。 如本申请中所使用的，表述〃 VAl 〃和〃 VA2"指与RNAl和RNA2相关的病毒，所述RNA被腺病毒转录但是不被翻译。VAl和VA2在对抗细胞防御机制中起作用。
通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。 本发明所述多肽，包括但不限于“肿瘤靶向肽”、“细胞穿膜肽”、“肿瘤细胞靶向性穿膜肽”，可按照常规的多肽合成技术进行固相合成或液相合成或液固相合成。 为此，本发明一方面公开了，一种肿瘤靶向多肽，其包含氨基酸序列为YXGXR所示的第一序列和氨基酸序列为YXGXR所示的另一第二序列，所述第一序列与所述第二序列之间通过连接肽链接，其中Y表示酪氨酸或其衍生物；G表示甘氨酸或其衍生物；R表示精氨酸或其衍生物；X表示含侧链带脂肪类基团或/和羟基类基团或它们组合或其衍生物的氨基酸。 现已发现有多种表皮生长因子类配体分子能与EGFR特异性的结合并发挥生物学效应。 这些配体分子包括表皮生长因子，转化生长因子(TGF-α)，双调蛋白(amphireguin，AR)、B-细胞素(beta-celluin，BTC)、肝素结合样表皮生长因子(HB-EGF)、表皮素(epiregulin，EPR)以及痘苗病毒来源的痘苗病毒生长因子等。
副甲状腺癌: 副甲状腺癌の原因
①TCS-ELBD-H2-pET28b质粒构建方案如实施例1中所述。 从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有TCS-ELBD-H2-pET28b质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。 ①EGFP-ELBD-TAT-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。 从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-ELBD-TAT-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。 ③将培养温度调整到15-20℃范围内，加入适量的IPTG(0.1-10mM)诱导目标蛋白表达，继续培养10-20h，低速离心收集菌体。 副甲状腺癌 ①EGFP-TAT-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。
例如，所述细胞可被用于在体外、离体或在体内产生所述腺病毒载体，或者所述细胞可以是被所述腺病毒载体感染的靶标（例如肿瘤细胞）。 此外，本发明为选择性治疗提供了工具和方法，而在健康组织中没有毒性或损伤。 副甲状腺癌2023 本发明的优势还包括与其它疗法相比不同的和减少的副作用。 重要的是，所述方法与许多其它形式的疗法（包括你化学疗法和放射疗法）是协同性的，并因而能够被用于组合方案中。 本发明提供了用于治疗癌症的工具，所述癌症是目前的方法难以治疗的。
副甲状腺癌: WO2018165867A1 - 肿瘤靶向多肽、制备方法及其应用
如权利要求15所述的缀合物，其特征在于所述细胞穿膜肽为SEQ ID NO.12氨基酸序列所示的多肽，来自HIV的反式激活蛋白TAT的氨基酸片段，EC-SOD来源的肝素结合域的氨基酸片段，HBEGF来源的肝素结合域的氨基酸片段，或它们的衍生物。 为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签多肽。 常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、六聚组氨酸肽(His.Tag)、蛋白质A和纤维素结合位点等。 通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。 如His.Tag与Ni-Chelating Sepharose柱特异性结合。 所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和Xa因子等，以获得目标蛋白。
副甲状腺癌: 副甲状腺がんはどんな病気ですか
在于细胞中生产GM-CSF的方法中，将包含本发明的载体的媒介运送至细胞内，并且表达GM-CSF基因，且蛋白质被翻译并以旁分泌的方式被分泌。 “媒介”可以是能够将本发明的载体递送至靶细胞的任何病毒载体、质粒或其它工具（例如颗粒）。 可使用本领域已知的任何常规的方法来将载体递送至细胞。
副甲状腺癌: 副甲状腺癌
实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。 ①MAP30-ELBD-H2-pET28b质粒构建方案如实施例1中所述。 随后从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有MAP30-ELBD-H2-pET28b质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。
但是对正常细胞来说，其膜受体，例如EGFR，表皮生长因子受体远低于癌细胞，而这一细胞间特性成为ELBD靶向肽具有肿瘤选择性的关键。 编码本发明的所述融合蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。 一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质粒载体。
副甲状腺癌: 患者様へ病気と治療
从图6中可以看出，ELBD能够在更低的浓度下与HeLa细胞表面受体结合，表明ELBD序列更容易与癌细胞表面结合，而更容易结合细胞表面进一步促进了重组蛋白的穿膜效率。 以EGFP-ELBD-HBD-pET28a质粒为载体，人工固相合成两端带有Sal I和Xho I酶切位点的DNA序列，该序列经过E.coli密码子优化，并编码H2穿膜肽，其中H2是另一种人源性穿膜肽，来源于肝素类生长因子。将EGFP-Tn-HBD-pET28a表达载体用Sal 副甲状腺癌2023 I与Xho I双酶切，并与合成的此片段利用T4DNA连接酶连接。 已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。 例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。 然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。
如本申请中所用的，表述“腺病毒血清型5仏肪）核酸骨架”指Ad5的基因组或部分基因组，其包含选自下列的一个或数个区域：Ad5起源的部分El、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、 L1、L2、L 3、L4、部分E3、L5和E4。 在另一个优选的载体中，腺病毒核酸骨架大部分源自Ad5并且结合了 Ad3的一部分（例如，衣壳结构的一部分）。 在治疗之前和之后，用⑶3、⑶8和六邻体特异性四聚抗体对收获自以Ad5-DM-GMCSF治疗的患者的白细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。 治疗将六邻体特异性细胞毒性T细胞从0.21%增加到了 2.72%。
副甲状腺癌: 副甲状腺腫瘍とは
与野生型的腺病毒基因组相比，本发明的腺病毒载体在El区（特别是在ElA区） 的CR2中缺少M个碱基对，以及在E 3区缺少gpWk和6. 在本发明的优选实施方式中，除了部分的El和E 3区外，本发明的溶瘤性腺病毒载体还包含选自E2，E4，和晚期区域的一个或多个区域；在本发明的优选实施方式中，所述溶瘤性腺病毒载体包含下列区域： 左 ITR、部分 El、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、Li、L2、L3、L4、部分 E3、L5、E4 和右 ITR。 在所述载体中，所述区域可以以任何顺序，但是在本发明的优选实施方式中，所述区域按照顺次顺序在5'至3'的方向上。
