再通過有限稀釋法進行亞克隆，以同樣ELISA方式篩選獲得8個陽性雜交瘤單克隆細胞株，分別命名為5A3、11G8、26E9、33H5、40D6、42F5、42H6和42A11。 根據本發明的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗原結合片段選自Fab、Fab’、(Fab’) 2、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、雙抗體（diabody）和單域抗體（sdAb）；和/或，所述抗體為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗原結合片段選自Fab、Fab’、(Fab’) 2、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、雙抗體（diabody）和單域抗體（sdAb）；和/或，所述抗體為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。
優選地，所述雙特異性或多特異性分子還包含至少一種具有針對第二靶標的第二結合特異性的分子（例如第二抗體）。 抗TrkA抗體或其抗原結合片段、其製備方法和應用 本發明屬於生物免疫技術領域，具體涉及能特異性結合人原肌球蛋白受體激酶A的抗TrkA抗體或其抗原結合片段，本發明還涉及所述抗體或其抗原結合片段的製備方法和用途。 一種用於治療多種病症或疾病的方法，其中，所述病症或疾病為疼痛、神經瘤或神經元病症；所述方法包括給予有需要的受試者治療有效量的權利要求1所述的抗體或其抗原結合片段。 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段進一步包含： 人免疫球蛋白的重鏈恒定區（CH）或其變體；和 人免疫球蛋白的輕鏈恒定區（CL）或其變體。 如實施例6B中所述，通過TrkA/Ba/F3的增殖來檢測抗TrkA抗體42F5人源化抗體對NGF/TrkA通路的抑制效果。 腫瘤痛 結果如圖21所示，人源化抗TrkA抗體均可抑制NGF誘導的TrkA/Ba/F3細胞的增殖，抑制程度與人鼠嵌合抗體42F5-Chi相當，IC50如表12所示。
腫瘤痛: 腫瘤痛
对乙酰氨基酚（英語：Acetaminophen），又称乙醯胺酚、必理痛、扑热息痛（Paracetamol），简称APAP。 可用於緩解輕度至中度的疼痛，本品對於孩童的退燒效果仍未有決定性結論。 次日於小鼠足底注射25µl CFA致炎，待足趾腫脹明顯後（造模後24小時左右），同樣方法檢測小鼠足底痛閾，此為給藥前的痛閾值（圖14）。 C57BL/6小鼠（浙江維通利華實驗動物技術有限公司），雄性，SPF級，6-8周齡，適應性飼養5天。
- FITC標記的山羊抗人Fc抗體（Abcam，ab97224）用流式緩衝液稀釋至5μg/mL，用以重懸細胞，室溫避光孵育30min，離心棄去上清並洗滌3次，用7AAD溶液（Biolegend，420403）重懸細胞，室溫孵育10min後使用流式細胞儀（BioRad, ZE5）檢測抗體的結合情況。
- 96孔酶標板每孔包被50ng 融合人Fc的TrkA胞外區（33-417）蛋白，洗滌三次後3%BSA封閉1小時。
- 每孔細胞加入10μL梯度稀釋的抗TrkA抗體，室溫孵育0.5小時後，每孔細胞加入10μL 50ng/mL的人NGF，使NGF終濃度為5ng/mL，梯度稀釋的抗NGF抗體終濃度最高為40μg/mL （266.67nM）。
- 準備6周齡BALB/c和C57小鼠（江蘇華阜康）各10只，每只動物皮下注射50μg免疫原（不包括佐劑品質，下同）。
- 將雜交瘤單克隆細胞株進行擴增並用無血清培養基培養，收集培養基並用蛋白G柱從中純化，以獲得鼠源抗人TrkA單克隆抗體5A3、11G8、26E9、33H5、40D6、42F5、42H6和42A11。
- 洗滌三次後加入辣根過氧化物酶偶聯山羊抗人IgG抗體（ThermoFisher，A18817），室溫反應1小時，三次洗滌後加入四甲基聯苯胺（TMB，Biolegend）顯色，1M HCl終止顯色，酶標儀讀取450nm處吸光值。
- 本發明還提供了藥物組合物，其含有所述的抗體或其抗原結合片段、所述的雙特異性或多特異性分子，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
採用相同的流式細胞術檢測人源化抗TrkA抗體和TrkA/CHO細胞的結合曲線，抗體由66.67μg/mL的濃度起始3倍梯度稀釋至共10個濃度，結果如圖19所示，抗TrkA抗體42F5人源化抗體和TrkA/CHO細胞的結合程度與人鼠嵌合抗體42F5-Chi相當，EC50在表10中總結。 根據上述獲得的雜交瘤細胞分泌的抗體的輕鏈可變區（VL）及重鏈可變區（VH）序列進行人源化改造。 將鼠源抗體的VL、VH的胺基酸序列在人胚胎系抗體胺基酸序列資料庫進行對比和檢索，找出同源性高的人類IGHV和IGKV序列作為人源化範本。 通過電腦類比技術，分析可變區與框架區胺基酸存在的可能空間位阻及相互影響，確定對維持人源化抗體活性比較關鍵的框架區胺基酸，在人源化過程中對這些胺基酸予以保留。 最後一次免疫後分離小鼠B細胞，與SP2/0細胞（中國科學院細胞庫，TCM18）混合，參照BTX公司電轉儀操作手冊進行融合。 融合細胞經過培養後採用酶聯免疫法（ELISA）篩選出與TrkA結合並能抑制人TrkA和配體NGF結合的雜交瘤細胞。
腫瘤痛: 腫瘤痛
結果如圖18所示，與人鼠嵌合抗體42F5-Chi相似，抗TrkA抗體42F5人源化抗體可以結合到TrkA/CHO細胞，但不能結合到TrkB/CHO，TrkC/CHO以及CHO-K1細胞，說明人源化抗TrkA抗體的特異性良好。 按照產品說明書培養細胞，在對數生長期收集細胞，使用流式緩衝液（PBS+2%FBS, pH 7.4）重懸細胞，在96孔板中每孔加入10 5細胞（50μl），並加入50μl 的100μg/mL的人源化抗TrkA抗體，室溫孵育60min，採用1200rpm轉速離心棄去上清並洗滌細胞3次。 FITC標記的山羊抗人Fc抗體（Abcam，ab97224）用流式緩衝液稀釋至5μg/mL，用以重懸細胞，室溫避光孵育30min，離心棄去上清並洗滌3次，用7AAD溶液（Biolegend，420403）重懸細胞，室溫孵育10min後使用流式細胞儀（BioRad, ZE5）檢測抗體的結合情況。 使用含有鼠Fc的人TrkA胞外區（33-417）蛋白研究抗TrkA抗體42F5人源化抗體的親和力，96孔酶標板每孔包被50ng人TrkA，洗滌及封閉後加入梯度稀釋的人源化抗體，室溫孵育1小時。 洗滌三次後加入辣根過氧化物酶偶聯山羊抗人IgG抗體（ThermoFisher，A18817），室溫反應1小時，三次洗滌後加入四甲基聯苯胺（TMB，Biolegend）顯色，1M HCl終止顯色，酶標儀讀取450nm處吸光值。 將獲得的人源化抗體重鏈可變區序列嫁接至人IgG4重鏈恒定區，輕鏈可變區序列嫁接至人Kappa輕鏈恒定區，並進行基因合成，經酶切後連入相應質粒中。
本發明還提供了編碼所述抗TrkA抗體或其抗原結合片段的分離的多核苷酸，以及包含所述分離的多核苷酸的載體。 本發明還提供了所述抗體或其抗原結合片段在製備用於治療疼痛的藥物中的用途。 使用含有人Fc的TrkA胞外區（33-417）（北京百普賽斯生物科技股份有限公司，TRA-H5259）蛋白檢測抗TrkA抗體的結合能力。 96孔酶標板每孔包被50ng人TrkA，洗滌及封閉後加入梯度稀釋的抗體，室溫孵育1小時。 洗滌三次後加入辣根過氧化物酶偶聯山羊抗小鼠Fc抗體（Biolegend, ），室溫孵育1小時，三次洗滌後加入四甲基聯苯胺（TMB，Biolegend，421101）顯色，1M HCl終止顯色，酶標儀讀取450nm吸光值。
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本發明還提供了多種病症或疾病的治療方法，其包括向有需要的受試者（其適當地為哺乳動物受試者特別是人類受試者）給予治療上有效量的抗體或其抗原結合片段，或所述的雙特異性或多特異性分子或藥物組合物或所述的宿主細胞在製備用於治療多種病症或疾病的藥物中的用途。 本發明提供的抗體作為藥物與現有抗體比較，具有更強的結合能力和特異性。 本發明還提供了藥物組合物，其含有所述的抗體或其抗原結合片段、所述的雙特異性或多特異性分子，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。 本發明還提供了一種所述的抗體或其抗原結合片段，或所述的雙特異性或多特異性分子或藥物組合物或所述的宿主細胞在製備用於治療多種病症或疾病的藥物中的用途。
基於現有技術的不足，本發明的主要目的在於提供一種親和力更高，特異性更強的抗TrkA抗體。 本發明還提供了所述抗體的製備方法和用途，本發明的抗TrkA抗體可以用於治療疼痛，包括炎症性疼痛、術後痛、神經病理痛、癌症疼痛、骨關節炎等。 與現有技術相比，本發明研發的抗TrkA抗體或其抗原結合片段具備更高的親和力高、更好的特異性和更強的活性。 本發明提供了一種抗TrkA抗體或其抗原結合片段、製備方法和應用。
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優選地，所述重鏈可變區中含有的3個CDR，和/或所述輕鏈可變區中含有的3個CDR，由Kabat或IMGT編號系統定義。
將構建好的質粒暫態轉染至CHO細胞中進行表達，經過7-10天表達，細胞培養上清用相應緩衝液（如磷酸鹽緩衝鹽水（pH7.4））平衡的MabSelect柱（GE Healthcare）進行純化，之後用檸檬酸鈉或其它緩衝液進行洗脫，經此步驟獲得的抗體，可通過SDS-PAGE或SEC-HPLC進行純度等鑒定，並用於後續其它表徵研究。 結果如圖13-16所示，給藥後24小時和48小時，抗TrkA抗體33H5和42F5均能明顯改善CFA引起的痛閾下降，與生理鹽水組相比，具有統計學差異。 96孔酶標板每孔包被50ng人TrkA胞外區蛋白，人TrkB胞外區蛋白（北京義翹神州科技有限公司，10047-H03H）,人TrkC胞外區蛋白（北京義翹神州科技有限公司，10048-H03H）按照實施例2中方法檢測抗TrkA抗體與人TrkA及兩個同家族蛋白TrkB、TrkC的結合情況。 96孔酶標板每孔包被50ng 融合人Fc的TrkA胞外區（33-417）蛋白，洗滌三次後3%BSA封閉1小時。 10,000ng/mL（66.67 nM）抗TrkA抗體依次3倍稀釋10個濃度至0.17ng/mL （0.0011 nM），每孔加入100μL，孵育30分鐘後每孔加入100μL的1μg/mL的生物素標記人NGF，室溫孵育1小時，洗滌三次。 加入鏈黴親和素標記辣根過氧化物酶（Streptavidin-HRP，Biolegend，405210）孵育0.5小時，洗滌三次後酶標板中加TMB，顯色終止後酶標儀讀取450nm吸光值。
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如請求項5所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述人源化抗體為42F5-01、42F5-03、42F5-04、42F5-05、42F5-08、42F5-11、42F5-13、42F5-14或42F5-15。 結合情況如表9和圖17所示，不同序列的抗TrkA抗體42F5人源化抗體均與人TrkA有相似的結合，結合程度與人鼠嵌合抗體42F5-Chi（含鼠源抗TrkA抗體42F5可變區和人抗體恒定區）相當。 其中對抗TrkA抗體42F5進行人源化改造，獲得了示例性抗體42F5-01，42F5-03，42F5-04，42F5-05，43F5-08，42F5-11。 腫瘤痛 在獲得的人源化抗體中，42F5-01和42F5-05重鏈可變區序列一致，人源化抗體42F5-03和42F5-11重鏈可變區序列一致，人源化抗體42F5-04和42F5-08重鏈可變區序列一致；人源化抗體42F5-03和42F5-04輕鏈可變區序列一致。 腫瘤痛 Ba/F3細胞的生長有依賴IL-3及不依賴IL-3兩種途徑，不依賴IL-3的生長需要Ba/F3細胞穩定表達活性激酶。
構建表達全長人TrkA的Ba/F3（TrkA/Ba/F3）細胞，該細胞增殖需要添加NGF誘導。 將雜交瘤單克隆細胞株進行擴增並用無血清培養基培養，收集培養基並用蛋白G柱從中純化，以獲得鼠源抗人TrkA單克隆抗體5A3、11G8、26E9、33H5、40D6、42F5、42H6和42A11。 腫瘤痛 將含有鼠Fc標籤的重組人TrkA蛋白（北京百普賽斯生物科技股份有限公司，TRA-H5254）作為免疫原與等量弗氏完全佐劑（Sigma-Alderich，F5881）混合乳化，用於初始免疫。 準備6周齡BALB/c和C57小鼠（江蘇華阜康）各10只，每只動物皮下注射50μg免疫原（不包括佐劑品質，下同）。 將免疫原與弗氏不完全佐劑（Sigma-Alderich，F5506）混合乳化，用於後續加強免疫。 初始免疫2周後每只動物腹腔注射25μg免疫原進行第一次加強免疫；2周後每只動物皮下注射25μg免疫原進行第二次加強免疫。
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適應期結束後將動物分成3組，分別為生理鹽水組、抗TrkA抗體33H5組、抗TrkA抗體42F5組，每組10只動物。 小鼠足底注射造模劑CFA之前，採用VonFrey測定痛閾，此為基礎痛閾（圖13）。 布洛芬（英語：Ibuprofen，商品名：芬必得、普羅芬），是一种非類固醇消炎藥（NSAID），用来止痛，退烧和消炎。
序列分析得到Kabat及IMGT系統界定的CDR，下表（表7）基於Kabat及IMGT系統的定義列出八個抗TrkA抗體的CDR。 隨後每組分別皮下注射生理鹽水、抗TrkA抗體33H5、抗TrkA抗體42F5，劑量10mg/kg，並測定給藥後24小時及48小時的痛閾（圖15，16），評價受試物對痛閾的影響。 8個鼠源抗TrkA抗體與TrkA（圖10）有高親和力，與TrkB（圖11）及TrkC（圖12）基本無結合。 8個雜交瘤分泌的抗TrkA抗體均以劑量依賴的方式結合至人TrkA胞外區（圖1），8個抗體與人TrkA結合的EC50如表1。 優選地，所述宿主細胞是哺乳動物細胞，更優選為人、鼠、羊、馬、狗或貓的細胞，進一步優選為中國倉鼠卵巢細胞。 更優選地，所述人源化抗體選自42F5-01、42F5-03、42F5-04、42F5-05、42F5-08、42F5-11、42F5-13、42F5-14或42F5-15。
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大约60%的人在使用任意一种NSAID后症状会有所改善，在一种药物不起作用时，通常推荐试用其他药物。 氯喹（Chloroquine），是一種用於治療及預防疟疾的藥物，该药以磷酸盐的形式（即磷酸氯喹）应用于临床。 偶爾也會用於治療腸道外的阿米巴原蟲症（英语：amebiasis）、類風濕性關節炎，以及紅斑性狼瘡。 腫瘤痛2023 如請求項10所述的方法，其中，所述疼痛與以下任意一種相關：炎症性疼痛、術後痛、神經病理痛、癌症疼痛。 儘管已經對本發明的具體實施方式進行了詳細說明和描述，但應當認識到，本發明不受所述具體實施方式的限制。
如實施例6A中所述，通過TF-1細胞的增殖來檢測抗TrkA抗體42F5人源化抗體對NGF/TrkA通路的抑制效果。 結果如圖20所示，抗TrkA抗體42F5人源化抗體均可抑制NGF誘導的TF-1細胞的增殖，抑制程度與人鼠嵌合抗體42F5-Chi相當，IC50如表11所示。 將TrkA/Ba/F3細胞培養於含10%FBS和100ng/mL NGF的RPMI1640培養基，收集細胞並徹底洗滌清除原生長培養基中的NGF，按照每孔3000細胞重懸於80μL不含NGF的培養基中，鋪到白色透底96孔細胞培養板（corning，3610）。 每孔細胞加入10μL梯度稀釋的抗TrkA抗體，室溫孵育0.5小時後，每孔細胞加入10μL 50ng/mL的人NGF，使NGF終濃度為5ng/mL，梯度稀釋的抗NGF抗體終濃度最高為40μg/mL （266.67nM）。 在37℃，5%CO 2培養箱中培養細胞48小時後加入100μL CellTiter-Glo®細胞活力檢測試劑（Promega，G7573），使用多功能酶標儀（SpectraMax）讀取光學luminescence信號。 根據本發明的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段帶有標記；優選地，所述抗體或其抗原結合片段帶有可檢測的標記，例如酶（例如辣根過氧化物酶）、放射性核素、螢光染料、發光物質（如化學發光物質）或生物素。
