最优选地，提供了至少90％或甚至95％类似的同源物或衍生物。 或者，可使用与CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的转录产物杂交的探针来检测是否存在CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的mRNA转录产物。 优选地，该探针选择性杂交CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的转录产物，即其不杂交230bp转录本或CGB2和/或CGB1基因的其他剪接变体转录本。 或者，可使用与CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的转录产物杂交的探针来测定是否存在CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的扩增的转录产物。 表面处生成的电场是一种控制表面处核苷酸的吸引和排斥的有用方法(Asanov 1998；Sosnowski 1997)。
28.如权利要求27所述的药物组合物，所述能够降低分泌的hCGβ水平的试剂是降低一种或多种CGB基因表达的试剂。 22.如权利要求15所述的方法，所述能够降低分泌的hCGβ水平的试剂是降低一种或多种CGB基因表达的试剂。 11.如权利要求5-9中任一项所述的方法，所述方法使用能够与所述CGB2和/或CGB1基因的核酸表达产物杂交的核酸探针。 使用Livak和Schmittgen所述的ΔΔCp方法对CGB基因表达进行相对定量。
除非另有说明，实际应用时，可忽略、改变或以不同组合合并单个特征。 适用于通过吸入给药的药物制剂包括可通过各种类型的计量加压气溶胶、喷雾器或吸入器的方式产生的细颗粒粉剂或喷雾剂。 适用于经鼻给药的药物制剂(其中运载体是固体)包括粒度范围为20-500微米的粗粉末，其以摄取鼻烟的方式给予，即从保持在靠近鼻部的处的粉末容器中通过鼻部通道迅速吸入。 对于以鼻喷雾或鼻液滴形式的给药，其中运载体是液体的合适制剂包括活性成分的水性或油性溶液。 可通过例如将siRNA纳入颗粒(以避免肾过滤)和通过化学修饰糖主链来延长siRNA分子的半衰期。 例如，siRNA可以是2′-O-甲基或2′-氟取代的，或其可在2′位处修饰为2′脱氧核糖。
引物和/或探针必须与CGB2和/或CGB1基因转录产物(如230bp转录产物)具有足够水平的相同性，使得其可在合适条件下与转录产物杂交。 可仅使用一种给定的条件进行清洗，或使用各条件(例如以上文所列顺序每次清洗10-15分钟)。 根据本发明，提供了一种检查癌性病症的方法，该方法包括显示CGB2和/或CGB1基因/假基因或至少一种这些基因/假基因的产物的表达。 具体而言，该方法检测和/或测量CGB2和/或CGB1基因的230bp剪接变体的表达。
使用这些小型铝镜以特定方式照射并与光沉积化学联用，可生成寡核苷酸探针的阵列。 脸癌 若干公司和实验室已实施该技术，特别是优创公司和尼布乐经公司。 用于制备、杂交和分析高密度阵列的完全一体的台式装置可将整个微阵列实验流水线化为一天内完成(例如Geniomone；Baum等)。 Geniomone使用DMD通过表面上生长的DNA链上光不稳定保护基团的空间选择性去保护来建立阵列。
针对管家基因GAPDH的水平标准化CGB基因的转录水平并使用平均交点值相对于使用非靶shRNA对照载体(校正物)转导的细胞中的基因表达水平计算。 最终结果表达为相对于校正物基因表达(设为100％)的CGB表达中的差异百分比。 对于癌症存在非常少的确定性测试且通常仅使用细胞学确认诊断。
为计算CGB基因的相对量，我们应用Livak和Schmittgen所述的ΔΔCp方法。 检查的癌细胞系中CGB1/2和CGB、CGB5、CGB7、CGB8的转录水平在其管家基因GAPDH含量的基础上标准化并相对于胎盘组织中的基因表达(校正物)进行计算。 最终结果表示为相对于校正物基因表达水平(等于1.0)的CGB表达中的N倍差异。 或者，能够降低分泌的hCGβ水平的试剂可以是能够特异性结合分泌的hCGβ的化合物。
优选地，当230bp剪接变体的表达水平超过CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8的表达水平时，指示存在hCGβ分泌性癌性病症，如CMAhCGβ分泌性癌性病症。 优选地，230bp剪接变体的表达水平剪接变体的表达水平超过CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8的表达水平的倍数为2、3、5、10或更高。 最优选地，当230bp剪接变体的表达水平超过CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8的表达水平的倍数为2时，指示存在hCGβ分泌性癌性病症，如CMAhCGβ分泌性癌性病症。 在优选的实施方式中，检测的表达产物是核酸，优选mRNA。 可使用基于230bp转录本和CGB1和/或CGB2基因的其他理论转录本和来自其他CGB基因(即CGB3、CGB5、CGB7和CGB8)的转录本之间的大小和/或序列差异的方法来检测是否存在核酸。 这些方法包括逆转录酶PCR、定量PCR、杂交技术(如凝胶电泳或毛细管电泳后的印迹)和任何核酸测序方法。
因此，进行本发明时，本领域技术人员可使用合适的前体，其通过酶Dicer的作用被原位(体内)加工为合适和有效的siRNA分子。 在一些实施方式中，siRNA可靶向基因组DNA并阻止或干扰基因转录。 在另一个方面中，本发明提供了一种用于治疗癌性病症(优选上皮癌)的组合物，其包含能够降低分泌性hCGβ的水平的试剂。 该组合物可包含阻止hCGβ表达的试剂，例如siRNA分子。
带电表面特别适用于避免表面上核苷酸的非特异性相互作用。 适当的表面包衣包括聚乙胺(参见Braslavsky,2003)和可获自VBC基因组公司(奥地利)的DNA结合载玻片。 表面处生成的电场是一种控制表面处核苷酸的吸引和排斥的有用方法(Asanov1998；Sosnowski1997)。 脸癌2023 最初完成LH-CGβ/基因簇的完整克隆后，其他研究表明存在两类生成hCGβ的基因，称作类型I和II。 类型I指似乎导致合成117位处具有丙氨酸残基的hCGβ蛋白的CGB7的基因产物且类型II指CGB、CGB5和CGB8的基因产物(其在117位处均编码天冬氨酸残基)。 这些研究形成了JMBidart美国专利号6,194,154的基础。
各新的阵列设计可简单和迅速地由软件具体化且无需使用照相平版掩模。 可制备阵列，从而使用针对基因组中特定区域的寡核苷酸的阵列或用在杂交起源的任何位置处起始过程的n聚体阵列(Gunderson等1998)来起始测序。 目前，Geniomone配置为合成48000个寡核苷酸。 然而，其可以在一次合成轮次中在一块芯片上合成至少192000条序列。 所有合成、杂交和清洗步骤都可在生产商提供的芯片的微流体通道内进行。
- 例如，该过程中使用的酶(如连接酶或聚合酶)可接合固体表面。
- 诸如BLASTx的程序将比较类似序列的最长延伸体并为该匹配赋值。
- 对于以鼻喷雾或鼻液滴形式的给药，其中运载体是液体的合适制剂包括活性成分的水性或油性溶液。
- 用于制备、杂交和分析高密度阵列的完全一体的台式装置可将整个微阵列实验流水线化为一天内完成(例如Geniomone；Baum等)。
- 因此，本发明的方法还可包括使用以下方法，所述方法包括核酸杂交以检测CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8)的转录产物。
- 可仅使用一种给定的条件进行清洗，或使用各条件(例如以上文所列顺序每次清洗10-15分钟)。
- 例如，siRNA可以是2′-O-甲基或2′-氟取代的，或其可在2′位处修饰为2′脱氧核糖。
- 本发明的试剂盒还可包含一种或多种赋形剂和/或试剂，以及用于进行本发明方法的材料。
胎盘对照组织也显示存在CGB、CGB5、7、8转录本。 标准化的平均交点值在癌细胞之间存在差异且显示CGB基因在所选癌细胞系中的不同表达水平。 MultiNA系统上qPCR产物的分离确认存在具有经计算大小的预测的PCR产物(图2-B)。 CGB1、2基因的转录本仅发现于膀胱癌细胞系SCaBER和RT112和乳腺癌细胞系C2235中(图2-A)。 脸癌2023 所有qPCR产物都通过MultiNA电泳分离，其中检测到231bp产物(预测是229bp产物)。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述正向引物与所述CGB2和/或CGB1基因的外显子1/外显子2边界处的序列杂交。 除非另有说明，该说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的各特征可由具有相同、等同或类似目的替代性特征替换。 脸癌 因此，除非另有说明，所公开的各特征仅仅是一系列等同或相似特征的一个示例。 对照载体pLKO.1-puro(无shRNA插入)(西格玛奥德里奇公司，英国普尔)以及未处理的野生型细胞。 应理解，下文和/或附图中显示的多种特征是优选的而非必需的。
这些siRNA分子可包括表3或4所列序列中的任意一种或多种(SEQIDNo16-31)。 SiRNA(也称作小干扰RNA或沉默RNA)是可用于干扰特定基因表达的一类双链RNA分子。 SiRNA分子存在于自然中，但也可在实验上用于抑制体外或体内的基因表达。 这可通过靶向mRNA以降解、阻止mRNA翻译或通过建立沉默的染色质区域来实现。 靶核苷酸和/或siRNA的核苷酸通常是连续的，但siRNA分子也可在递送前经历加工或化学修饰以提高其稳定性和/或效力。 脸癌2023 也可使用双链DNA分子，其之后在体内被加工为较小的siRNA分子，例如通过酶Dicer的作用。
可以计算最优比对的氨基酸相同性或相似性(相同性加氨基酸类型的保守性)。 诸如BLASTx的程序将比较类似序列的最长延伸体并为该匹配赋值。 因此可以获得其中发现若干类似区域的比较，其各自具有不同的评分。 该样品可以是血液、尿液、脑脊液、痰液、支气管灌洗液和唾液或组织样品。 组织样品包括活检材料、脱落细胞、循环的肿瘤细胞、刷取活检样品和通过拭子获得的细胞(例如鸡上皮细胞)和刷取活检样品(如宫颈刮片样品)。 活检材料包括通过任何活检技术获得的细胞，包括刷取活检、切除活检、切开活检、针吸或核心活检。
使用人膀胱癌细胞系RT112、SCaBER和T24；乳腺癌细胞系C2235和C2238；前列腺癌LN-CAP和PC-3。 本发明的siRNA可通过合适转染试剂的单独、同时或依次递送来给予患者，例如在局部递送至组织(如肺、阴道、皮下肿瘤、肌肉、眼或神经组织)期间。 可通过例如快速高压静脉注射(“水力疗法”)或受体介导的系统性递送来实现系统性递送。 脸癌2023 “基本相同”在本发明中指至少60％相同的核酸或氨基酸序列。 本发明的序列可至少60％、70％、80％、90％、95％、97.5％或99％相同。
适用于透皮给药的药物制剂的形式可以是离散贴片，其旨在与接受者的表皮保留延长时间的紧密接触。 例如，可通过离子电渗从贴片中递送活性成分，参见PharmaceuticalResearch,3,318。 适用于口服给药的药物制剂的形式可以是离散单元如胶囊剂或片剂；粉末剂或颗粒剂；水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；可食用的泡沫剂或发泡剂；或水包油液体乳液或油包水液体乳液。
使用血球计数器估计培养后细胞数目并将其用于标准化蛋白质浓度(1×106个细胞)。 针对重组hCGβ(西格玛公司)(范围为50pg/l至0.5pg/l)的标准曲线校正试验，其已针对hCGβ的第一国际参比制备物(批次75/551；NIBSC公司，英国波特斯巴)校正。 脸癌 使用USAhCG参比服务内部完整hCGELISA定量完整hCG浓度，其中利用McAb2119和4001-POD的抗体组合。
本发明中，“侵略性”癌性病症是转移性和/或侵染性的病症。 CGB7的表达水平似乎总是低于基因CGB1和CGB2(其总被忽略)。 CGB1和CGB2在癌症中的表达程度高于CGB、CGB5和CGB8且形成本发明的基础，因为其负责与转移性癌症相关的hCGβ蛋白的表达和分泌。 27.一种药物组合物，所述药物组合物包含能够降低分泌的hCGβ水平的试剂和药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。 20.如权利要求12或13所述的试剂盒，所述试剂盒还包含能够与用作对照的管家基因杂交的引物或杂交探针。
癌细胞系中CGB、CGB5、7、8mRNA的表达发生变化但在大多数情况中小于胎盘中观察到的表达水平的1％。 膀胱癌细胞系T24中的表达是1.6％，SCaBER是3.1％，其两种乳腺癌细胞系表现是6％和25％，这些百分比都基于胎盘对照组织中观察到的表达水平(参见表格)。 根据针对DNA-500试剂盒(岛津公司)的生产商说明书通过微芯片电泳系统MCE202MultiNA(岛津公司)来检测实时PCR产物。 基于25bpDNA梯标(英杰公司)的分离来估计DNA产物的长度。 应用MultiNA电芯片系统可通过MultiNAViewer软件非常精确地估计qPCR产物的大小。
为形成双链体，杂交区域之间无需完全互补；仅需要配对碱基的数目足以在使用的杂交条件下维持双链体。 例如，42℃下0.2×SSC/0.1％SDS(中等严谨性的条件)；和68℃下0.1×SSC(高严谨性的条件)。 脸癌2023 可仅使用一种给定的条件进行清洗，或可使用各条件(例如以上文所列顺序每次清洗10-15分钟)。
这些抗体优选特异性针对翻译自CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和CGB8)转录本的前蛋白。 这些抗体或凝集素优选特异性针对翻译自230bp剪接变体转录本的前蛋白，例如SEQ ID No.2和/或SEQ Id No.16的蛋白质或CMAhCGβ。 该序列不同于其他CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和CGB8)生成的和CGB2和/或CGB1基因的其他剪接变体转录本理论上生成的前蛋白中发现的序列，如表2所示。 克隆的实时PCR分析显示，与使用非靶shRNA对照载体转导的SCaBER细胞相比，hCGβmRNA转录本水平下降约60％-80％(分别为克隆1和克隆2)(图4)。 类似地，克隆1和克隆2的培养基中的hCGβ蛋白浓度分别下降至20％和9％。
3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括检测和/或测量基因CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8中任意一种或多种的表达。 可能利用单克隆抗体或其它抗体并采用重组DNA技术等技术来产生保留原始抗体的特异性的其它抗体或嵌合型分子。 这些技术可包括将编码某抗体的免疫球蛋白可变区，或互补决定区的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区。 该表面优选是玻璃、二氧化硅或聚合物(如PMDS或含氟聚合物)。 基材优选是载玻片、盖玻片、硅晶片、微制造的芯片或多孔板(如平底光学级96孔板)。 例如，可以使用康宁公司(美国)或埃斯皮生物技术公司(爱沙尼亚)供应的氨基硅烷包被的表面。
- 在ANOVA或Friedman双向分析中使用StatsDirectTM(埃尔垂卡姆公司，英国柴郡)软件分析统计学显著性(数据未正常分配)。
- 能够降低分泌性hCGβ水平的试剂可以是降低一种或多种CG基因(具体是CG2和/或CG1)的表达的试剂。
- 完整的hCG分子是异质二聚体，其包含特定的β亚基，该亚基非共价结合至α亚基，这对于其它糖蛋白是常见的。
- 这些siRNA分子可包括表3或4所列序列中的任意一种或多种(SEQ ID No 16-31)。
- 可仅使用一种给定的条件进行清洗，或可使用各条件(例如以上文所列顺序每次清洗10-15分钟)。
这些siRNA分子可包括表3或4所列序列中的任意一种或多种(SEQ ID No 16-31)。 一条单链核酸被认为与另一条杂交的条件是其之间形成双链体。 这发生在一条核酸含有与另一条反向或互补的序列时(相同的排列形成基因组中DNA的正义和反义链的天然相互作用并成为双螺旋构象的基础)。
或者，该组合物可包含结合分泌的hCGβ的试剂(如抗体)。 特异性CGB基因沉默之前和之后的75cm2烧瓶中生长融合细胞培养物的介质经收获以用于hCGβ蛋白定量。 使用前文所述双位点FBT-11hCGβ酶免疫试验估计hCGβ浓度。
