圖5係表示於具有BRAF基因突變且對BRAF抑制劑具有耐受性之黑色素瘤細胞株中對GST-π減弱所帶來之細胞增殖抑制效果進行驗證之結果之特性圖。 圖3係表示於具有BRAF基因突變之大腸癌細胞株中對將GST-πsiRNA及BRAF抑制劑併用時之細胞增殖抑制效果進行驗證之結果之特性圖。 進而，根據本發明之篩選方法，可選擇針對具有BRAF基因突變之細胞非常強力地誘導細胞死亡及/或抑制細胞增殖之藥劑。 腦膜癌2023 又，已知GST-π與c-Jun N末端激酶形成複合體而阻礙JNK活性(非專利文獻8)。 進而，已知GST-π與和細胞之應力應答相關聯之蛋白質之S-麩胱甘肽化相關(非專利文獻9)。
- 又，已知GST-π與c-Jun N末端激酶形成複合體而阻礙JNK活性(非專利文獻8)。
- 關於所使用之培養基，CACO-2設為MEM+20%、FBS+0.1mM及NEAA，A375設為DMEM+15%及FBS，SK-MEL-28設為EMEM+10%及FBS，A2058設為DMEM+10%及FBS，Malme-3M設為IMDM+20%及FBS，任一者均添加抗生物質。
- 如請求項10之篩選方法，其包括如下步驟：使被檢測物質與具有BRAF基因突變、且對BRAF抑制劑具有耐受性之細胞接觸之步驟；測定上述細胞中之GST-π之表現量之步驟；及於與被檢測物質之非存在下測定之情形時相比該表現量降低之情況下，選擇其作為抑制上述GST-π之產生之藥物之步驟。
- 根據本實施例之結果暗示，關於此種具有BRAF基因突變之癌，抑制GST-π之藥劑對細胞增殖抑制有效，因此期待將該等與難治性癌之新穎之治療法聯繫起來。
- 載體較佳為至少包含增強所擔載之核酸之表現之啟動子，於此情形時，該核酸較佳為與該啟動子可作動地連結。
- 又，本發明之處理方法所使用之藥物之用量對於業者而言為公知或可藉由上述試驗等適當確定。
- 又，關於該方法中之藥物，已如上所述，藥物之有效量可為於所投予之細胞中誘導細胞 死亡或抑制細胞增殖之量。
- 於本說明書所記載之本發明之處理方法中投予之活性成分之具體之用量可考慮與需要處理之對象相關之各種條件例如症狀之嚴重程度、對象之一般健康狀態、年齡、體重、對象之性別、飲食、投予之時期及頻率、併用之醫藥、對治療之反應性、劑形、及對治療之適應性等而確定。
如上所述，藉由西方墨點確認使GST-π siRNA作用於PLX4720耐受性A375細胞時之GST-π之表現。 即，使用於GST-π siRNA之轉染後之上述各時點採取之細胞進行GST-π減弱之西方墨點解析。 又，用語「處理」於在本說明書中使用之情形時，包含以疾病之治癒、暫時之緩解或預防等為目的之醫學上所容許之所有種類之預防性及/或治療性干擾。
腦膜癌: 腦膜癌病的症狀有哪些和怎麼治療
作為起因於具有BRAF基因突變之癌細胞之疾病，並未限定，可列舉高表現GST-π之癌等，於較多之情形時，具有BRAF基因突變之癌包含於高表現GST-π之癌中。 腦膜癌2023 又，根據本發明之細胞增殖抑制劑，針對具有BRAF基因突變之細胞，可非常強力地抑制細胞增殖。 因此，本發明之細胞增殖抑制劑可作為起因於具有BRAF基因突變之細胞之增殖異常之疾病之治療用 之醫藥組合物而發揮非常高之藥效。 根據本發明之細胞死亡誘導劑，針對具有BRAF基因突變之細胞，可非常強力地誘導細胞死亡。
該量為公知或可藉由使用培養細胞等之in vitro試驗等適當確定，業者熟知此種試驗法。 關於上述有效量，於將藥物投予至特定之癌細胞集團之情形時，可並非為對該細胞集團之所有細胞造成細胞死亡或增殖抑制之量。 例如上述有效量可為對該細胞集團中之細胞之1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、8%以上、10%以上、12%以上、15%以上、20%以上、進而25%以上等造成細胞凋亡或增殖抑制之量。
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繼而，將35μL之Lipofectamine 腦膜癌 RNAi MAX(Invitrogen公司)於1mL之Opti-MEM I Reduced Serum Medium(GIBCO公司)中稀釋，並平穩地混合。 於將稀釋後之GST-π siRNA與稀釋後之Lipofectamine RNAi MAX平穩地混合後，於室溫下培養10分鐘。 於該期間內，將培養基更換成10mL之Opti-MEM I Reduced Serum Medium。 於培養10分鐘後，將GST-π siRNA與Lipofectamine RNAi MAX之複合體添加至細胞中，於37℃下並於包含5%CO2之大氣下進行培養。
BRAF基因係對構成RAS-RAF-MAPK路徑之絲胺酸/蘇胺酸激酶之一種進行編碼之基因。 已知具有V600E突變之BRAF使下游之訊號始終活化，即便不存在來自細胞外部之刺激，亦會導致細胞之增殖。 腦膜癌 近年來，瞭解到獲得了BRAF抑制劑耐受性之黑色素瘤細胞株與黑色素瘤之再發相關。 因此，為了確認GST-π是否促進BRAF抑制劑耐受性黑色素瘤之CRAF依存性，於PLX4720耐受性A375中減弱GST-π。 對GST-π減弱進行了確認，結果於第2天與第3天GST-π表現被抑制(圖6)。
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進而，可對包含將所製造之醫藥組合物之有效量投予至必需該有效量之對象之起因於細胞之增殖異常之疾病進行處理、治療。 一種抑制GST-π之產生之藥物之用途，其用於製造起因於具有BRAF基因突變、且對BRAF抑制劑具有耐受性之細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物，上述藥物係選自由RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸及表現該等中之至少1種之載體所組成之群中之物質。 本發明係關於一種針對具有BRAF基因突變之細胞(例如癌細胞之一種)之細胞死亡誘導劑、該細胞之增殖抑制劑及起因於該細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物，進而係關於一種對細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑進行篩選之方法。 一種起因於具有BRAF基因突變之細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥之組合，其包含抑制GST-π之產生之藥物，該藥物係選自由RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸及表現該等中之至少1種之載體所組成之群中之物質，且與BRAF抑制劑另外投予。
關於本發明之劑或組合物中之有效成分之調配量，於投予劑或組合物之情形時，可為誘導細胞凋亡等細胞死亡及/或抑制細胞增殖之量。 腦膜癌 該量為公知或可藉由使用培養細胞等之in 腦膜癌2023 vitro(活體外)試驗或小鼠、大鼠、狗或豬等模型動物中之試驗適當決定，業者熟知此種試驗法。 細胞凋亡之誘導可利用各種已知之方法例如DNA片段化、膜聯蛋白V對細胞膜之結合、線粒體膜電位之變化、半胱天冬酶之活化等細胞凋亡特有之現象之檢測或TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End 腦膜癌2023 Labeling，末端脫氧核苷酸轉移酶介導之dUTP缺口末端標記)染色等進行評價。 又，細胞增殖之抑制可利用各種已知之方法例如經時性之活細胞數之計數、腫瘤之尺寸、體積或重量之測定、DNA合成量之測定、WST-1法、BrdU(溴脫氧尿苷)法、3H胸苷摻入法等進行評價。
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因此，本發明之細胞死亡誘導劑可作為起因於具有BRAF基因突變之細胞之增殖異常之疾病之治療用之醫藥組合物發揮非常高之藥效。 藉由本實施例，顯示出可有效地抑制具有BRAF基因突變並且對BRAF抑制劑具有耐受性之細胞(BRAF抑制劑耐受性細胞)之增殖。 根據該結果，可期待可防止或者減少BRAF抑制劑耐受性細胞成為一個因素之疾病例如黑色素瘤之再發等效果。 首先，以與實施例1相同之方式分別培養1種大腸癌細胞株(CACO-2)及2種黑色素瘤細胞株(SK-MEL-28及A2058)，並於轉染之前一天，以成為10~20%融合之方式使用不含抗生物質之培養基將其等播種至100mm組織培養塑膠盤。 向1mL之Opti-MEM I Reduced Serum Medium(GIBCO公司)中添加600pmol GST-π siRNA(GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT，siRNA ID#2385，Ambion公司(序列編號3))，並平穩地混合。
圖4、係表示於具有BRAF基因突變之黑色素瘤細胞株中對將GST-π siRNA及BRAF抑制劑併用時之細胞增殖抑制效果進行驗證之結果之特性圖。 圖1係表示於具有BRAF基因突變之大腸癌細胞株中對GST-π減弱所帶來之細胞增殖抑制效果進行驗證之結果(細胞數測定結果、西方墨點結果)之特性圖。 將於培養1個月後生存之細胞株作為PLX4720耐受性A375細胞用於本實施例。
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作為抑制GST-π之產生之藥物，並不限定於此，例如可列舉針對將GST-π編碼之DNA之RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸及表現該等之載體等。 腦膜癌2023 再者，關於GST-π，如上所述，可根據具體之鹼基序列及胺基酸序列進行特定，但不得不考慮到於生物個體間可能會產生鹼基序列或胺基酸序列之突變(包含各種類型)。 即，GST-π並不限定於具有與登錄於資料庫中之胺基酸序列相同之序列之蛋白質，亦包含具有相對於該序列而1個或2個以上、典型而言1個或數個、例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸不同之序列且具有與GST-π同等之功能者。 又，GST-π亦包含對包含相對於上述具體之鹼基序列具有70%以上、80%以上、90%以上、95%以上或97%以上之相同性之鹼基序列並具有與GST-π同等之功能之蛋白質進行編碼者。 再者，關於GST-π之具體之功能，如上所述，意指將麩胱甘肽結合作為觸媒之酵素活性。
可是，如上所述，抑制GST-π之藥物對具有BRAF基因突變之細胞表現出細胞死亡誘導及/或細胞增殖抑制。 因此，可將對GST-π之抑制作為指標，對具有BRAF基因突變之細胞之細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑進行篩選。 即，可抑制GST-π之物質成為具有BRAF基因突變之細胞(典型而言為癌細胞)之細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑之候補物質。 作為此種化合物，可使用有機化合物(胺基酸、多肽或其衍生物、低分子化合物、糖、高分子化合物等)、無機化合物等。 作為多肽之衍生物，可列舉對修飾基加成而獲得之修飾多肽、藉由改變胺基酸殘基而獲得之變異體多肽等。 進而，此種化合物既可為單一化合物，亦可為化合物基因庫、基因基因庫之表現產物、細胞萃取物、細胞培養上清液、醱酵微生物產生物、海洋生物萃取物、植物萃取物等。
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因此，本發明亦關於一種包含單獨或者組合包含本發明之各種劑或組合物可包含之活性成分之1個或2個以上之容器之組合物之製備 套組、以及以此種套組之形態提供之各種劑或組合物之必需構成要素。 腦膜癌 本發明之套組除上述以外，亦包含記載有本發明之各種劑或組合物之製備方法或投予方法等之指示例如說明書或CD(Compact Disc，光碟)、DVD(Digital Versatile Disc，數位多功能光碟)等電子記錄媒體等。 又，本發明之套組可包含用以完成本發明之各種劑或組合物之全部構成要素，亦可未必包含全部構成要素。 因此，本發明之套組亦可包含通常可於醫療現場或實驗設施等獲取之試劑或溶劑例如無菌水或生理鹽水、葡萄糖溶液等。 所謂BRAF基因中之突變，意指對野生型BRAF之胺基酸序列之缺失、替換、加成、插入等突變、對BRAF基因之表現控制區域之突變。
BRAF基因中之突變於惡性度較高之腫瘤中被確認到，且已知為大腸癌中無法切除之大腸癌之預後不良因子。 黑色素瘤之患者之一半具有BRAF基因突變，於轉移能力較高之情形時，致死率‧惡性度最高。 根據本實施例之結果暗示，關於此種具有BRAF基因突變之癌，抑制GST-π之藥劑對細胞增殖抑制有效，因此期待將該等與難治性癌之新穎之治療法聯繫起來。 於本實施例中，對使抑制GST-π之藥物作用於具有BRAF基因突變之細胞時之細胞增殖抑制效果進行了研究。 首先，於37℃下並於包含5%CO2之大氣下培養1種大腸癌細胞株(CACO-2)、4種黑色素瘤細胞株(A375、SK-MEL-28、A2058、Malme-3M)作為具有BRAF基因突變之癌細胞。 關於所使用之培養基，CACO-2設為MEM+20%、FBS+0.1mM及NEAA，A375設為DMEM+15%及FBS，SK-MEL-28設為EMEM+10%及FBS，A2058設為DMEM+10%及FBS，Malme-3M設為IMDM+20%及FBS，任一者均添加抗生物質。
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例如於1次投予使用複數個單位之組合物之情形時，1個單位之組合物中所調配之有效成分之量可設為1次投予所必需之有效成分之量之複數分之一。 可是，將包含麩胱甘肽作為觸媒之酵素之一之麩胱甘肽-S-轉移酶已知為使藥劑等物質與麩胱甘肽偶合而將其製成水溶性之物質之酵素。 GST基於胺基酸序列，被分類為α、μ、ω、π、θ及ζ之6種同功酶作為代表性者。 其中，尤其是GST-π(glutathione S-transferase pi，亦稱為GSTP1)之表現於各種癌細胞中增大，指出其可能會成為對於一部分抗癌劑之耐受性之一個因素。 腦膜癌 實際上已知若使GST-π過度表現，並使針對GST-π之反義DNA(Deoxyribonucleic Acid，脫氧核糖核酸)或GST-π抑制劑作用於表現出藥物耐受性之癌細胞系，則藥劑耐受性被抑制(非專利文獻4~6)。 進而，於最近之報告中報告有若使針對GST-π之siRNA(Small interfering RNA，小干擾RNA)作用於使GST-π過度表現之雄性素非依存性前列腺癌細胞系統，則其增殖被抑制，從而細胞凋亡增大(非專利文獻7)。
報告有若使針對GST-π之siRNA作用於KRAS具有突變之癌細胞系，則Akt之活化被抑制，自噬增大，但細胞凋亡之誘導成為中等程度(非專利文獻11)。 於專利文獻1中揭示有藉由將抑制GST-π之藥物與3-甲基腺嘌呤等自噬抑制劑作為活性成分，可誘導癌細胞之細胞凋亡。 進而，於專利文獻2中揭示有若同時地抑制GST-π與Akt等之表現，則細胞增殖被抑制而誘導細胞死亡且藉由抑制GST-π之表現而誘導之自噬因同時地抑制Akt等之表現而被顯著地抑制。 將與大腸癌細胞株相關之結果示於圖1，將與黑色素瘤細胞株相關之結果示於圖2。 再者，於圖1及2中一併表示對細胞數進行測定之結果與利用西方墨點之解析之結果。 如圖1及2所示，關於大腸癌細胞株及黑色素瘤細胞株，於具有BRAF基因突變之癌細胞中，均藉由作為抑制GST-π之藥劑之GST-π siRNA減弱GST-π，藉此細胞增殖能力被顯著地抑制。
