製備完成的血小板可保存於20°C至24°C，待培養細胞時再加入細胞培養組合物中，但以配製後立即使用為佳。 在本實驗中，使用醣化終產物（advanced glycation end product，AGE）誘導幹細胞損傷或老化，再使用實施例之細胞培養組合物作為培養液來培養受損或老化的幹細胞。 並且，透過SA-β-gal套組來評估包含粒線體的細胞培養組合物對於受損或老化的幹細胞的影響，並以老化細胞比例（%）來表示老化程度。
幹細胞培養液包含Keratinocyte SFM 溶液（Gibco）、bovine pituitary extract（BPE，Gibco）、重量百分濃度10%之胎牛血清（HyClone）。 首先，在培養皿中將人類脂肪幹細胞培養至細胞數為1.5×108個細胞，再以杜氏磷酸鹽緩衝液（DPBS）沖洗培養皿中的人類脂肪幹細胞。 接著，移除培養皿中的杜氏磷酸鹽緩衝液後，在培養皿中加入細胞剝離用之胰蛋白酶（Trypsin），並在37℃下反應3分鐘後，再加入幹細胞培養液以終止反應。 接著，將人類脂肪幹細胞自培養皿中沖洗下來後打散，以600 g離心10分鐘後，移除上清液。 接著，將離心後留下的人類脂肪幹細胞及80毫升之IBC-1緩衝液（225 mM甘露醇、75mM蔗糖、0.1 mM EDTA、30 mM Tris-HCl pH 7.4）加入均質器中，並在冰上以均質器對人類脂肪幹細胞進行研磨15次。
腎臟細胞: TWM517199U - 細胞承載裝置及細胞培養系統
如請求項8所述的細胞培養系統，其中，該附著型細胞是選自於由下列所構成的群組：間質幹細胞、纖維母細胞、上皮細胞、內皮細胞、星狀細胞、腎臟細胞、肝細胞、表皮細胞、角膜細胞，以及它們的組合。 綜上所述，本新型細胞承載裝置1藉由該彈性佳且耐用的彈性膜2，無需額外進行化學修飾或蛋白質塗佈，即可提供良好的細胞生長環境及細胞附著效果，適用於觀察附著型細胞9，故確實能達成本新型之目的。 在本新型的第二實施例中，該細胞承載裝置還包含一承載柱，設置在該彈性膜底部，並與該支撐結構間隔設置，且該彈性膜是部分貼附於該承載柱。 如請求項1所述之細胞培養組合物，更包含補體C3，其中每一毫升的該細胞培養組合物包含0.1微克至20微克的補體C3。
該等孔道4是連通至該彈性膜2底部，並利用一外接的真空設備(圖未示)透過該等孔道4進行抽氣，以使該彈性膜2承載有該附著型細胞9的部分受到鉛直方向的應力而向下凹陷；當停止抽氣時，該彈性膜2會回復到抽氣前非凹陷的狀態。 腎臟細胞2023 透過改變抽氣的壓力及頻率，該彈性膜2可在凹陷狀態與非凹陷狀態之間振動，藉以對該彈性膜2上的附著型細胞9提供鉛直方向的振動應力。 此外，觀察附著型細胞的裝置不僅需要提供良好的細胞生長環境，還需要具備良好的細胞附著效果，因此，通常需要額外進行化學修飾或蛋白質塗佈，以增進細胞附著效果。 由於生物體中許多細胞所生長的位置是處於動態環境，例如：心、肺或胃等器官壁會隨著壓力而膨脹及縮小，肌肉或皮膚表面會隨著壓力而拉伸，因此，當對於細胞進行體外觀察時，需要模擬出一個符合生物體的動態環境，以承載及培養細胞。 阿爾瑪藍（Alamar blue）係用於檢測細胞活力的檢測試劑。 檢測套組內的刃天青（resazurin）是一種氧化還原指示劑，其為無毒、可穿透細胞膜且低螢光性之深藍色染料。
腎臟細胞: TW202200781A - 細胞培養組合物及其用途
該彈性膜2為上述製得的聚氨酯彈性膜，且該彈性膜2上附著有附著型細胞9(大小僅為示意)，可供模擬細胞在會頻繁膨脹及縮小的心、肺或胃等器官壁之動態生長環境。 一種細胞培養組合物在改善受損或老化的幹細胞的功能的用途，其中該細胞培養組合物包含一培養基以及粒線體。 補體C3濃度可為0.1 μg/mL至20 μg/mL，或者可為10 μg/mL。 AMSC的培養基可為DMEM/F12（Gibco），營養添加物可包含重量百分濃度10%胎牛血清，粒線體濃度可為1微克/毫升（μg/mL）至100 μg/mL，可為5 μg/mL至80 μg/mL，可為15 μg/mL至40 μg/mL，或者可為1 μg/mL、15 μg/mL或40 μg/mL。 HepG2的培養基可為DMEM/F12，營養添加物可包含重量百分濃度10%胎牛血清，粒線體濃度可為1微克/毫升（μg/mL）至100 μg/mL，可為5 μg/mL至80 μg/mL，可為15 μg/mL至40 μg/mL，或者可為15 μg/mL或40 μg/mL。
根據本發明一實施例，細胞培養組合物可促進細胞生長，提高細胞增生率。 使用本發明實施例之細胞培養組合物所培養的細胞可包含任意體細胞。 體細胞可包含視網膜細胞、肝臟細胞、腎臟細胞、肌腱細胞、皮膚細胞或免疫細胞。
腎臟細胞: TW202200781A - 細胞培養組合物及其用途
惟以上所述者，僅為本新型之實施例而已，當不能以此限定本新型實施之範圍，凡是依本新型申請專利範圍及專利說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本新型專利涵蓋之範圍內。 本新型將就以下實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本新型實施之限制。 腎臟細胞2023 腎臟細胞2023 更佳地，該脂肪族多異氰酸酯、該聚醚多元醇與該鏈延長劑的莫耳比例範圍為2：1：1~3：2：1，以得到彈性佳(伸長率高)且耐用(強度高)的聚氨酯。
- 在粒線體沉澱物中加入1.5毫升之IBC-2緩衝液（225 mM甘露醇、75mM蔗糖、30 mM Tris-HCl pH 7.4）及蛋白質分解酶抑制劑，並置於4℃下保存。
- 體細胞可為視網膜細胞、肝臟細胞、腎臟細胞、肌腱細胞、皮膚細胞或免疫細胞。
- ARPE-19的實驗結果請參考表19及圖11，圖11顯示使用含粒線體及補體C3之實施例之細胞培養組合物培養ARPE-19的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。
- 根據本發明一實施例，細胞培養組合物可改善受損或老化的細胞的老化程度。
接著，以1000 g離心研磨後的人類脂肪幹細胞15分鐘，將上清液收集至另一離心管，再以9000 g再次離心收集的上清液10分鐘，移除再次離心後得到的上清液，獲得之沉澱物即為粒線體。 在粒線體沉澱物中加入1.5毫升之IBC-2緩衝液（225 mM甘露醇、75mM蔗糖、30 mM Tris-HCl pH 腎臟細胞 7.4）及蛋白質分解酶抑制劑，並置於4℃下保存。 上述實驗結果顯示，使用含有粒線體的細胞培養組合物來培養受損或老化的幹細胞，可降低老化細胞比例，且老化細胞比例隨著粒線體的濃度增加而降低，表示含有粒線體的細胞培養組合物確實有助於改善受損或老化的幹細胞的生長，同時有助於改善受損或老化的幹細胞的功能。 使用不含粒線體的培養液，將各細胞培養至其體積為培養皿的八分滿時，移除培養皿中的培養液並使用磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）潤洗細胞。 接著，將ARPE-19以每孔2×104個細胞的密度於實施例1-1及1-2之細胞培養組合物中培養24或48小時。
腎臟細胞: TWM517199U - 細胞承載裝置及細胞培養系統
本發明一實施例提供一種細胞培養組合物在促進細胞生長的用途，其中該細胞培養組合物包含一培養基以及粒線體。 依據本新型的細胞培養系統，該附著型細胞包括那些為熟習此項技藝者可易於獲得的附著型細胞株(例如，可購自於國內或國外寄存機構者)，或者利用本技藝中所慣用的細胞分離方法而從天然來源中所分離純化出的附著型細胞株。 較佳地，該附著型細胞是選自於由下列所構成的群組：間質幹細胞、纖維母細胞、上皮細胞、內皮細胞、星狀細胞、腎臟細胞、肝細胞、表皮細胞、角膜細胞，以及它們的組合。 因此，本新型之另一目的，即在提供一種細胞培養系統，包含如上所述的細胞承載裝置，及一附著於該彈性膜上的附著型細胞。 細胞承載裝置及細胞培養系統 本新型是有關於一種細胞承載裝置，特別是指一種包含一聚氨酯彈性膜、一支撐結構及至少一孔道的細胞承載裝置，以及包含該細胞承載裝置的細胞培養系統。 營養添加物可包含胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）、鹽類、胺基酸、馬血清、人類血清、維生素、葡萄糖、生長因子、蛋白質、動物體萃取物、碳水化合物、肌醇、巰乙醇或葉酸，但不以此為限。
根據上述實驗結果，由對照組可知，在細胞培養基中添加血小板可提高細胞增生率，且增生率隨著血小板的數量增加而提升。 由實施例8-1至8-3可知，使用含有粒線體的細胞培養組合物來培養細胞，可使細胞具有提高的增生率，且增生率隨著粒線體的濃度增加而提升，表示含有粒線體的細胞培養組合物確實有助於細胞的生長。 由對照組8-1、實施例8-3及實施例8-4可知，使用含有粒線體及血小板的細胞培養組合物來培養細胞，可進一步提升細胞的增生率。 實施例8-3及實施例8-4證實在粒線體濃度皆為40 μg/mL的情況下，添加1×106個/mL之血小板可使細胞增生率進一步提升。 實施例8-4及對照組8-1證實在血小板數量皆為1×106的情況下，添加40 μg/mL之粒線體可使細胞增生率超過血小板數量為1×108（對照組8-3）始能達到的效果。
腎臟細胞: TWM517199U - 細胞承載裝置及細胞培養系統
圖6顯示使用實施例之細胞培養組合物培養受損或老化的ADSC的老化細胞比例。 腎臟細胞 腎臟細胞 圖7顯示使用實施例之細胞培養組合物培養受損或老化的AMSC的老化細胞比例。 圖8顯示使用僅含血小板之對照組之細胞培養組合物培養CCD-996SK的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。 圖9顯示使用僅含粒線體之實施例之細胞培養組合物培養CCD-996SK的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。 圖10顯示使用含粒線體及血小板之實施例之細胞培養組合物培養CCD-996SK的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。
- 接者，將培養皿中的各細胞及培養液移至離心管中，以每分鐘轉速1000（Revolutions Per Minute，rpm）離心5分鐘後，移除上清液。
- 培養完成後，使用磷酸鹽緩衝液清洗各細胞，並將培養液更換為含有阿爾瑪藍的培養液，培養3小時。
- 如請求項9所述的細胞培養系統，其中，該附著型細胞是選自於胎盤-衍生的間質幹細胞、胚胎腎臟細胞、胚胎纖維母細胞或其組合。
- 本新型將就以下實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本新型實施之限制。
接著，將白細胞層與HEP buffer（140 mM NaCl、2.7mM KCl、3.8 mM HEPES、5 mM 腎臟細胞2023 EGTA，pH 7.4）以1：1的比例均勻混合，再加入Prostaglandin E1使其濃度為1 μM以防止血小板活化。 接著，將白細胞層以100 g離心15至20分鐘使白血球及殘餘的紅血球沉澱，將含有血小板的上清液收集至新的離心管中。 接著，將含有血小板的上清液以800 g離心15至20分鐘使血小板沉澱。 移除上清液，使用wash buffer（10 mM檸檬酸鈉、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1%(w/v) dextrose）將所沉澱的血小板潤洗兩次。 接著，使用Tyrode’s buffer（134 mM NaCl、12 mM NaHCO3、2.9 mM KCl、0.34 mM Na2HPO4、1 mM MgCl2、10 mM HEPES，pH 7.4）進行回溶，以血球計數器進行小小板計數。
腎臟細胞: TW202200781A - 細胞培養組合物及其用途
在貧瘠的培養基中或是嚴苛的培養條件下，細胞成長的速率較慢，生長出來的細胞可能較脆弱、不易存活，甚至無法成長。 培養出的細胞若是不夠健康或是成長的速度過慢，對後續的實驗或研究皆會造成不利的影響。 將上述製得的聚氨酯彈性膜以ASTM D5034進行伸長率測試，結果為800%，顯示上述製得的聚氨酯彈性膜具有相當高的伸長率。 較佳地，該聚氨酯是使聚醚多元醇與脂肪族多 異氰酸酯反應，接著與鏈延長劑反應而得。
將HepG2以每孔5×104個細胞的密度於實施例2-1及2-2之細胞培養組合物中培養24小時。 將MDCK以每孔5×104個細胞的密度於實施例3-1及3-2之細胞培養組合物中培養24小時。 將人類肌腱細胞以每孔2×104個細胞的密度於實施例4-1至4-4之細胞培養組合物中培養24或48小時。 將自然殺手細胞以每孔2×104個細胞的密度於實施例5-1至5-4之細胞培養組合物中培養24或48小時。
腎臟細胞: TW202200781A - 細胞培養組合物及其用途
接著，在培養皿中加入0.25%之胰蛋白酶並使胰蛋白酶在37℃下反應5分鐘，再加入培養液以終止胰蛋白酶的反應。 接者，將培養皿中的各細胞及培養液移至離心管中，以每分鐘轉速1000（Revolutions Per Minute，rpm）離心5分鐘後，移除上清液。 接著，將幹細胞以每孔1.5×104個細胞的密度培養24小時。 接著，於孔盤中加入AGE，使幹細胞在含有濃度為400 腎臟細胞 μg/mL的AGE的培養液中培養4小時。 接著，將含有AGE的細胞培養液移除，加入實施例之細胞培養組合物，使幹細胞在含有不同粒線體濃度的細胞培養組合物中培養24小時。
細胞培養組合物中粒線體的濃度為0、1 μg/mL、15 μg/mL或40 μg/mL。 培養完成後，使用磷酸鹽緩衝液清洗各細胞並使用SA-β-gal套組進行細胞老化的評估。 ARPE-19的實驗結果請參考表6及圖1A及圖1B，圖1A及圖1B顯示使用實施例之細胞培養組合物培養ARPE-19的細胞增生率，圖1A之培養時間為24小時，圖1B之培養時間為48小時。 HepG2的實驗結果請參考表7及圖2，圖2顯示使用實施例之細胞培養組合物培養HepG2的細胞增生率，培養時間為24小時。 MDCK的實驗結果請參考表8及圖3，圖3顯示使用實施例之細胞培養組合物培養MDCK的細胞增生率，培養時間為24小時。
