圖11I顯示在第2、4及10週齡以小鼠設計載體處理之小鼠肝臟檢測到的mRNA含量。 為了評估在PAHenu2小鼠中靶基因座整合的數量和保真度，進行兩個方法以檢測整合事件：ddPCR及次世代定序。 為了判定靶基因插入在整合位點是否伴隨新生突變，對橫跨左及右同源臂且進入靶插入位點的基因體序列的PCR擴增子進行定序。
在經處理之2週齡小鼠（第9組），經過30週Phe含量維持在≤360 µM之臨床相對含量。 在第9組（經過30週）、第10組（經過42週）及第11組（經過42週）中觀察到血清Tyr濃度相應的增加（圖11D）。 分子療法 此等數據顯示劑量為1E14 vg/kg之封裝於AAVHSC15內的人類設計載體足夠在幼鼠肝臟生長期間提供持續療效，且該效果在施用後維持至少30週。
評估了橫跨每個同源臂的插入特異性擴增子（hPAH依賴的PCR）或橫跨每個同源臂的WT／未插入等位基因（沒有hPAH插入）。 在封裝系統之某些實施例中，第一、第二及/或第三載體含於一或多種質體內。 本文所描述之rAAV、醫藥組成物或多核苷酸，其用於治療PKU。 本文所描述之rAAV、醫藥組成物或多核苷酸，其用於治療患有PKU之個體的方法，該方法包含向個體施用有效量之rAAV、醫藥組成物或多核苷酸。 在另一態樣中，本發明提供一種用於重組製備rAAV之方法，該方法包括將本文所描述之封裝系統引入至細胞中，在該條件下由此產生rAAV。 在某些實施例中，靶基因座5'端之核苷酸係在PAH基因的內含子中。
圖 5為顯示在靜脈內投與封裝於AAV9或AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000（在每種情況下以2e13 vg/kg之劑量投與）之後，ARSA（-/-）小鼠之大腦中的以每個經轉導之細胞計的載體基因組之數目之圖。 圖 3A為顯示在對照組小鼠（WT/Het）及ARSA（-/-）小鼠中，在四週時量測之髓鞘及淋巴細胞蛋白質（MAL）mRNA轉錄物之含量之圖。 圖 3B為顯示與年齡匹配野生型小鼠及用媒劑處理之ARSA（-/-）小鼠相比，在用4e13 vg/kg之劑量（劑量-4）之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000處理之ARSA（-/-）小鼠中偵測到的MAL轉錄物之含量之圖。 圖 3C為顯示在投與4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000或媒劑對照物之後第12或52週，在野生型小鼠或ARSA（-/-）小鼠中偵測到的MAL轉錄物複本數之圖。 此實例提供用於在經載體轉導之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中的hARSA之表現之人類ARSA轉移載體pHMI-5004。 除表現hARSA以外，此載體經設計以亦表現人類鞘脂激活蛋白B（SapB）。
- 在某些實施例中，待轉導之細胞在哺乳動物個體中且AAV以可有效轉導個體中之細胞之量向個體施用。
- 另外又或者，在某些實施例中，PAH基因座可使用結合至靶基因座側翼PAH基因區域之引子經由PCR或使用結合rAAV基因體中一區域（例如包含對於靶基因座非原生之外源性序列的區域）之引子經由LAM-PCR從轉導細胞群體提取之DNA擴增而來。
- 食蟹獼猴在PAH基因座與人類同源臂序列PAH-032h呈現94.2%序列一致性。
- 已證實鞘脂激活蛋白B（SapB）可刺激半乳糖-腦甘脂硫酸酯由ARSA進行之水解、GM1神經節苷脂由β-半乳糖苷酶進行之水解及球形三醯神經醯胺由α-半乳糖A進行之水解。
- 如請求項1至68中任一項之rAAV，其中在標準AAV施用條件下，在缺少外源性核酸酶的情況下當向植入有人類肝細胞的小鼠施用AAV時，該編輯元件整合到該靶基因座的效率至少為1%。
在某些實施例中，內含子元件為包含來自同一物種不同基因之至少一部分內含子序列的外源性內含子元件。 在某些實施例中，內含子元件為包含合成內含子序列的外源性內含子元件。 在某些實施例中，內含子元件為包含來自不同物種或來自同一物種的不同基因的至少一種內含子序列之組合及/或合成內含子序列的外源性內含子元件。
此基因中之突變與高歇氏病（Gaucher disease）及異染性白質失養症相關。 已證實鞘脂激活蛋白B（SapB）可刺激半乳糖-腦甘脂硫酸酯由ARSA進行之水解、GM1神經節苷脂由β-半乳糖苷酶進行之水解及球形三醯神經醯胺由α-半乳糖A進行之水解。 在某些實施例中，rAAV基因體進一步包含位於5’同源臂核苷酸序列的5’端之5’反向末端重複(5’ ITR)核苷酸序列，及位於3’同源臂核苷酸序列的3’端之3’反向末端重複(3’ ITR)核苷酸序列。 在另一態樣中，本發明提供用於本文中所揭示之重組腺相關病毒（rAAV）之重組製備之封裝系統。 在一個態樣中，本文中提供新穎重組AAV（例如複製缺陷型AAV）組成物，其適用於在具有降低的或以其他方式缺乏ARSA基因功能之細胞中表現ARSA多肽。 分子療法2023 鑒於同源重組可能由載體的同源臂及基因體中脫靶位置之間的短延伸序列相似性所驅動，開發了基於PCR測定法以具體地測試整合至包含類似於同源臂之序列的基因體區域。
如本文所用，術語「可操作地連接」用於描述TRE與待轉錄之編碼序列之間的連接。 通常，基因表現置於包含一或多個啟動子及/或增強子元件之TRE的控制下。 若編碼序列之轉錄受TRE控制或影響，則編碼序列「可操作地連接」至TRE。
圖 9F為顯示在投與單次靜脈內4e13 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之ARSA（-/-）小鼠之大腦中，以每奈克RNA計的ARSA轉錄物之複本之數目之圖。 發現在AAVHSC15與AAV9衣殼介導之遞送之間的比較中，AAVHSC15在腦部中顯著優於AAV9。 圖5顯示在2e13 vg/kg之封裝於AAV9或AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000的劑量下，腦部中之以每個經轉導之細胞計的載體基因組之數目。 如所顯示，與AAV9衣殼相比，當轉移載體pHMI-5000封裝於AAVHSC15衣殼中時，觀測到高十倍的以每個細胞計的載體基因組計數。 圖6顯示對於以所指示之劑量投與之封裝於AAV9或AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000，所量測的正常人類ARSA酶活性水準之百分比。
如請求項1至70中任一項之rAAV、如請求項71之醫藥組成物或如請求項72之多核苷酸，其用於治療患有PKU之個體的方法，該方法包含向該個體施用有效量之該rAAV、該醫藥組成物或該多核苷酸。 一種用於治療患有苯丙酮尿症之個體的方法，該方法包含向該個體施用有效量之如請求項1至70中任一項之rAAV、如請求項71之醫藥組成物或如請求項72之多核苷酸。 如請求項1至41中任一項之rAAV，其中該5'及3'同源臂核苷酸序列中的每個獨立地具有約100至約2000之核苷酸長度。 如請求項1至36中任一項之rAAV，其中該第一基因體區域係位於第一編輯窗中，以及該第二基因體區域係位於第二編輯窗中。 圖 分子療法 8A-8C顯示為隨時間推移在PAHenu2小鼠中PAH-006m-LP-1對血液Phe濃度之影響的圖。 圖 8A顯示全數據集，而圖 8B顯示在某時間範圍內具有減少的y軸刻度的數據，以顯示劑量之間差異。
一種用於治療患有異染性白質失養症（MLD）之個體之方法，該方法包含向該個體投與有效量之rAAV，該rAAV包含： 分子療法2023 （a）AAV衣殼，其包含衣殼蛋白質；及 （b）轉移基因組，其包含可操作地連接至以緘默方式改變之ARSA編碼序列之轉錄調節元件。 在封裝系統之某些具體實施例中，輔助病毒係選自由以下組成之群組：腺病毒、疱疹病毒（包括單純疱疹病毒（HSV））、痘病毒（諸如痘瘡病毒）、細胞巨大病毒（CMV）及桿狀病毒。 在封裝系統之某些具體實施例中，其中輔助病毒為腺病毒，腺病毒基因組包含一或多種選自由以下組成之群組之腺病毒RNA基因：El、E2、E4及VA。 在封裝系統之某些具體實施例中，其中輔助病毒為HSV，HSV基因組包含選自由以下組成之群組之HSV基因中之一或多者：UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22及UL30/UL42。 本文中所揭示之方法的有利之處尤其在於其能夠活體內及活體外在細胞中以高效率表現ARSA蛋白質。
- 如圖17中所示，偵測到高於治療閾值（野生型人類腦部含量之15%）之hARSA活性水準，如由虛線指示。
- 由於IL2rg-/-及Rag2-/-剔除之這些小鼠缺乏B細胞、T細胞及NK細胞，導致人體細胞植入的可接受性。
- 圖9E及9F顯示按指定劑量給予游離轉基因表達載體（圖9E）或PAH-006m-LP1（圖9F）劑量之PAHenu2小鼠的載體基因體含量，其在每個情況下封裝於AAVHSC15衣殼內。
- 在某些具體實施例中，SapB編碼序列編碼突變型SapB蛋白質（例如人類SapB蛋白質）之胺基酸序列，其中突變型SapB多肽為野生型SapB多肽之功能等效物，亦即，可充當野生型SapB多肽。
- 在封裝系統之某些實施例中，第一、第二及/或第三載體含於一或多種重組輔助病毒內。
- 人類設計載體包含人類同源臂序列且由於序列差異將不會期望通過同源重組整合至小鼠基因體中，因此在這些實驗中人類設計載體僅作爲游離基因的控制組。
如本文所用，術語「編輯元件」係指當在靶基因座上整合修飾靶基因座時，rAAV基因體的一部分。 編輯元件可介導一或多種在靶基因座之核苷酸之插入、缺失或取代。 在另一態樣中，本發明提供一種用於治療患有苯丙酮尿症之個體的方法，該方法包含向個體施用有效量之如本文所描述之rAAV或如本文所描述之醫藥組成物。 一種用於rAAV之重組製備之方法，該方法包含在可產生該rAAV之條件下將如請求項74至79中任一項之封裝系統引入細胞中。
在某些具體實施例中，尤其感興趣的是腦中之腦橋及髓質、脊髓之上升束及其任何組合中之細胞。 在某些具體實施例中，尤其感興趣的是選自由以下組成之群組之中樞神經系統區域中的需要活性內源ARSA之細胞：脊髓、運動皮質、感覺皮質、丘腦、海馬區、殼核、小腦（例如小腦核）及其任何組合。 在某些具體實施例中，尤其感興趣的是中樞神經系統（CNS）中之運動神經元及星形膠質細胞分佈、CNS中之寡樹突神經膠質細胞（上升纖維）、CNS中之大腦皮質之細胞群體以及周邊神經系統（PNS）中之感覺神經元。
如請求項1之方法，其中該細胞為神經元及/或神經膠細胞，視情況其中該細胞為中樞神經系統及/或周邊神經系統之神經元及/或神經膠細胞。 圖 17為顯示投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5005的非人類靈長類動物之中樞神經系統（CNS）及腦脊髓液（CSF）中之ARSA活性之圖。 本文中所引用之所有參考文獻（例如公開案或專利案或專利申請案）皆以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其併入程度如同各個別參考文獻（例如公開案或專利案或專利申請案）具體且個別地指示為出於所有目的以全文引用之方式併入一般。 本文中所揭示之載體可封裝於AAV衣殼中，諸如（但不限於）AAVHSC5、AAVHSC7、AAVHSC15或AAVHSC17衣殼。 在以2e13 vg/kg投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之小鼠中，觀測到與在以4e13 vg/kg或更高的劑量進行投藥之小鼠中所發現相同的組織學分佈。
圖 分子療法2023 12D 分子療法 及 分子療法 12E顯示為以劑量1E14 vg/kg施用封裝於AAVHSC15衣殼內之PAH-006m-LP-1的PAHenu2小鼠在注射長達42週後對血清Phe（圖 12D）及Tyr（圖 分子療法2023 12E）影響的圖。 控制組FRG小鼠施用製劑緩衝液，並在施用後第4（第5組）或第12週（第6組）犧牲。 為了判定隨時間推移載體之動能及耐久性，10週齡雄性PAHenu2小鼠以1E14 vg/kg的劑量施用封裝於AAVHSC15衣殼之小鼠特異性基因轉移／基因編輯AAV載體(PAH-006m-LP-1)。 六個群體在施用劑量第1、2、4、8及16週後犧牲（每群體有五隻小鼠）。 整合動能藉由監測在不同時間點內隨時間推移之血清Phe含量、隨時間推移之載體基因體含量、隨時間推移之PAH轉基因mRNA表達含量及隨時間推移之靶向整合含量來調查。 分子療法2023 發現載體基因體含量、PAH轉基因mRNA表達含量及整合頻率隨時間推移而穩定（圖12A-12C）。
在封裝系統之某些實施例中，封裝系統進一步包含第三載體，例如輔助病毒載體，其包含有包含一或多種輔助病毒基因之第四核苷酸序列。 分子療法2023 第三載體可為獨立第三載體、與第一載體整合在一起或與第二載體整合在一起。 另外又或者，在某些實施例中，PAH基因座可使用結合至靶基因座側翼PAH基因區域之引子經由PCR或使用結合rAAV基因體中一區域（例如包含對於靶基因座非原生之外源性序列的區域）之引子經由LAM-PCR從轉導細胞群體提取之DNA擴增而來。
