在一個實施例中，方法進一步包含在進行個體之血清中存在抗AAV衣殼抗體之測定之後向所述個體投予有效量的皮質類固醇之步驟。 本發明亦關於包含治療有效量之用於治療罹患A型血友病之個體的重組AAV FVIII病毒之組合物。 在一個實施例中，AAV FVIII病毒為AAV5-FVIII-SQ。 在另一實施例中，AAV FVIII病毒包含p-100 ATGB載 體。 在某些實施例中，包含治療有效量之AAV FVIII病毒之組合物於包含用於預防及/或治療與投予AAV FVIII病毒相關之任何肝毒性的預防性及/或治療性皮質類固醇之組合物一起投予。
在其他實施例中，DA神經元用於治療或改善神經精神病症之一或多種症狀，諸如注意力缺失過動症、妥瑞氏症候群、精神分裂症、精神病及抑鬱症。 在又其他實施例中，使用DA神經元治療DA神經元受損之患者。 在一些實施例中，DA神經元分化之特徵在於自發節律性動作電位，及在注入去極化電流後具有峰值頻率調適之高頻率動作電位。 所產生多巴胺之含量係藉由量測動作電位在其已達到其最大幅度之一半之點處的寬度(尖峰半最大寬度)而計算。 分子治療2023 多巴胺神經元(亦稱為多巴胺能神經元)包括神經元細胞，其表現酪胺酸羥化酶，亦即用於多巴胺合成之限速酶。 在一些實施例中，多巴胺神經元分泌神經傳遞質多巴胺，且幾乎沒有或沒有多巴胺羥化酶之表現。
分子治療: Taxes and tax credits
A型血友病很適合於基因置換方法，因為臨床表現可歸因於血漿中缺乏以分鐘量(200ng/ml)循環之單一基因產物。 不需要基因表現之嚴格調控，且FVIII水準之適度增加(血漿含量之任何2ng/ml增加誘發1%活性增加)可改善嚴重形式之疾病。 分子治療 因此，內源性FVIII活性之相對較小變化導致疾病表現型之臨床相關改進。 最後，可使用證實之定量終點而非易於使用已確立實驗室技術分析之定性終點評估對基因轉導之反應。
在一些實施例中，在第一次投與神經細胞之前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天，投與免疫抑制劑及/或免疫調節劑。 在一些實施例中，在第一次投與神經細胞之前至少1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週或更多週，投與免疫抑制劑及/或免疫調節劑。 在特定實施例中，在第一次投與神經細胞之後不向患者投與免疫抑制劑及/或免疫調節劑，或在第一次投與神經細胞之後至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天投與該免疫抑制劑及/或免疫調節劑。
分子治療: 接種疫苗
舉例而言，包含AAV rep及cap基因之質體(或多個質體)及可選標記物(如新黴素抗性基因)可整合於細胞之基因組中。 昆蟲或哺乳動物細胞可隨後經輔助病毒(例如提供輔助功能之腺病毒或桿狀病毒)及包含5'及3' AAV 分子治療 ITR(及必要時，編碼異源蛋白之核苷酸序列)之病毒載體共感染。 此方法之優點為細胞為可選的且適合於大規模產生重組AAV。
- 在第三十二態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：39中所闡述之核酸序列之構築體103AT 2×MG bGH polyA。
- 在一些實施例中，細胞亦包括修飾以增加選自由以下組成之群組的一者之表現：CD200、HLA-G、HLA-E、HLA-C、HLA-E重鏈、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、IL-10、IL-35、FASL、Serpinb9、CCL21、CCL22及Mfge8。
- 如本領域中熟習此項技術者應瞭解，用於分化之方法視使用已知技術之所需細胞類型而定。
- 長度為4934個鹼基且具有呈正向之內含子ApoE/C1增強子之所得Proto 6載體以示意性形式顯示於圖3C中，且序列闡述於SEQ ID NO：7中。
- 在給予6.0E12 vg/kg AAV5-FVIII-SQ(低劑量)之動物中，當藉由團式注射或30分鐘輸注靜脈內投予時，肝臟RNA及DNA含量或血漿FVIII-SQ蛋白及活性中存在極小差異。
在16週之主要終點分析之後，將接著持續大致5年評估安全性及功效。 由於上文所述且用於非臨床/臨床前研究之AAV5-FVIII-SQ液體調配物展現重組AAV與玻璃及塑膠表面之顯著吸附，在本文中進行操作以產生具有用於人類臨床研究之有利特性的新穎AAV5-FVIII-SQ調配物。 純化AAV5-FVIII-SQ如下調配用於人類臨床研究。 在給予6E12及2E13 vg/kg AAV5-FVIII-SQ之食蟹獼猴及恆河猴中，經6週評估FVIII-SQ之相對表現。 未觀測到肝臟臨床化學之AAV5-FVIII-SQ相關變化，指示無肝功能障礙。 相比於恆河猴，食蟹獼猴中之血漿FVIII-SQ蛋白含量較大。
分子治療: 疫苗超級英雄漫畫
在一些情況下，轉錄活化因子可為或含有異源反式活化域之全部或一部分。 舉例而言，在一些實施例中，轉錄活化因子係選自單純疱疹衍生之反式活化域、Dnmt3a甲基轉移酶域、p65、VP16及VP64。 在一些實施例中，靶向域經組態以靶向目標基因之啟動子區以促進轉錄起始、一或多個轉錄強化子或活化子及/或RNA聚合酶之結合。 在某些態樣中，目標位點在基因之轉錄起始位點之任一側上的600個鹼基對內。 在一些情況下，諸如CRISPR/Cas系統之基因編輯系統用於促進將致耐受性因子(諸如致耐受性因子)插入至安全港基因座(諸如AAVS 1基因座)中以主動抑制免疫排斥。
- 所有標題及章節名稱僅用於清晰及參考目的，且不應視為以任何方式為限制性的。
- 如請求項27之用途，其中所述藥物包含約6E12 vg/kg至約6E13 vg/kg重組AAV FVIII病毒。
- 所述管以全速離心大致10 分鐘且上清液倒入含有異丙醇之管中。
- 除預期免疫原性以外，未在非臨床程式中觀測到獨特AAV5衣殼相關毒性。
- 離心塊使用滴管再懸浮於再懸浮緩衝液中，後跟溶解緩衝液，且所述管經倒置若干次以混合緩衝液且接著在室溫下培育大致5分鐘。
在一些實施例中，神經細胞無法將小神經膠質細胞募集及/或活化至移植或植入部位。 在一些實施例中，神經細胞無法在移植或植入部位處促進或誘導小神經膠質細胞之增殖。 在一些實施例中，接受個體中之小神經膠質細胞不滲入含有神經細胞之移植或植入部位。
分子治療: 核酸医薬
在一些實施例中，在該患者經歷繼發於該神經病症或病況之該患者之血腦障壁的後續破壞之後，該神經細胞群在該患者中維持長期存活。 在許多實施例中，在該患者經歷繼發於該神經病症或病況之該患者之血腦障壁的後續破壞之後，該神經細胞群在該患者中維持長期功能。 在一些實施例中，該神經細胞群在該患者之血腦障壁之破壞後展現出長期存活。 在許多實施例中，該神經細胞群在該患者之血腦障壁之該破壞後展現出長期功能。
在給予6.0E12 vg/kg AAV5-FVIII-SQ之動物中，靜脈內輸注及緩慢團式注射組中之hFVIII-SQ載體基因組/肝細胞分別為5.06E-2及3.50E-2。 靜脈內輸注及團式注射組中之肝臟中之每μg RNA之FVIII-SQ表現複本分別為3.76E4及1.87E4。 在給予2.0E13vg/kg AAV5-FVIII-SQ之動物中，DNA值就輸注組而言為每細胞0.342個載體基因組且就團式注射組而言為每細 胞0.316個載體基因組。 肝臟中之每μg RNA之FVIII-SQ表現複本就輸注組而言為2.35E5且就團式注射組而言為1.53E5。 此研究之目標為比較單次靜脈內團式注射或30分鐘靜脈內輸注6.0E12及2.0E13 vg/kg對給藥後5週之Rag2-/-小鼠中之肝臟組織中之FVIII-SQ DNA及RNA及血漿FVIII-SQ蛋白及活性水準的影響。
分子治療: 疫苗安全
本文提供神經細胞用於治療神經疾病之用途，其包含自幹細胞活體外分化之神經元，該神經元表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 本文揭示包括逃避免疫識別諸如小神經膠質細胞反應之神經細胞在內之細胞以及其使用及生成之相關方法。 在一些實施例中，本文所揭示之該等細胞具有降低之MHC I及/或MHC II人類白血球抗原之含量或活性，且在一些情況下，外源性表現CD47。 在一些實施例中，該等細胞衍生自逃避接受個體之免疫識別的富潛能幹細胞。
一種神經細胞用於治療神經疾病之用途，其包含自幹細胞活體外分化之神經元，該神經元表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 本文提供一種自幹細胞活體外分化之神經元，該神經元表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 本發明亦關於在有需要之個體中增加功能FVIII蛋白表現之方法，其包含向個體投予如本文所述之重組AAV FVIII病毒之步驟，所述病毒視情況可如上文所述調配，其中此類投予導致個體血流中功能FVIII蛋白增加之表現或功能FVIII蛋白增加之濃度。 在本發明之一個態樣中，投予步驟導致個體血流中至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10或大於10 IU/dl因子VIII蛋白，較佳個體血流中至少約5 IU/dl因子VIII蛋白之表現。 本發明提供腺相關病毒因子VIII編碼/表現載體及病毒，包括具有高表現活性之AAV FVIII載體及表現全長或截短功能FVIII蛋白之AAV FVIII載體。
分子治療: 免疫系統嚴重或中度受損兒童接種第三劑疫苗的資格
一般而言，此等再程式化因子基因提供於諸如此項技術中已知及市售之附加型載體上。 在一些實施例中，位點特異性結合域衍生自CRISPR/Cas系統。 在一些實施例中，向患者，例如人類患者投與低免疫原性DA神經元以治療神經退化性疾病或病況。 分子治療 在一些情況下，神經退化性疾病或病況係選自由帕金森氏症、杭丁頓氏症及多發性硬化症組成之群組。
長度為4934個鹼基且具有呈反向之內含子ApoE/C1增強子之所得Proto 7載體以示意性形式顯示於圖3D中，且序列闡述於SEQ ID NO：8中。 在增加B域及a3域缺失FVIII之表現的嘗試中，129鹼基之截短FVIII內含子插入Proto 4載體中之密碼子優化FVIII序列之外顯子1與2之間。 長度為4934個鹼基之所得Proto 5載體以示意性形式顯示於圖3B中，且序列闡述於SEQ ID NO：6中。 本發明之完全包裝AAV FVIII載體具有高載體產率與極少或無碎片狀基因組污染物，且相比於圖1中示出的載體較佳1.5倍、2倍、3倍、4倍、或5倍或大於5倍的載體產率。 在一些實施例中，目標位點係在目標基因之轉錄起始位點上游。
分子治療: 疫苗安全
在一些實施例中，富潛能幹細胞經修飾以展現減少表現之MHC I類及/或II類人類白血球抗原且展現增加之CD24表現。 在一些情況下，細胞藉由攜帶一或多個CD24轉基因而過度表現CD24。 本文提供一種自幹細胞活體外分化之多巴胺神經元，該多巴胺神經元表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。
相同上述方法可用於評估及偵測預先用所關注的治療性AAV病毒治療之患者中之抗AAV衣殼免疫反應之產生。 因此，此等技術不僅可用於評估用治療性FVIII AAV病毒治療之前的抗AAV衣殼抗體之存在，其亦可用於在投予之後評估及量測針對投予之治療性FVIII AAV病毒之免疫反應的誘導。 因此，本發明涵蓋組合偵測人類血清中之抗AAV衣殼抗體及投予治療性FVIII AAV病毒以治療A型血友病之技術的方法，其中偵測人類血清中之抗AAV衣殼抗體之技術可在投予治療性FVIII AAV病毒之前或之後進行。 為了使藉由全身性AAV介導之因子VIII基因轉移之成功肝臟轉導的可能性最大化，在針對如上文所述之人類患者的治療方案中投予AAV載體之前，預期患者可評估能夠阻斷細胞轉導或以其他方式減少治療方案之總效率之抗AAV衣殼抗體的存在。 此類抗體可存在於預期患者之血清中且可針對任何血清型之AAV衣殼。
分子治療: 免疫系統嚴重或中度受損兒童接種第三劑疫苗的資格
在一些實施例中，使用陽性選擇策略、陰性選擇策略或兩者選擇或純化神經膠質細胞。 測定神經細胞是否逃避免疫識別之方法包括但不限於IFN-γ Elispot分析、小神經膠質細胞殺滅分析、細胞植入動物模型、細胞介素釋放分析、ELISA、使用生物發光成像之殺滅分析或鉻釋放分析或Xcelligence®分析、混合淋巴細胞反應、免疫螢光分析等。 應注意，申請專利範圍可經起草以排除任何視情況選用之要素。 因此，此陳述意欲與對所主張要素之敘述結合充當使用諸如「僅僅」、「僅」及其類似術語之排他性術語或使用「否定性」限制之前提基礎。 分子治療2023 如本領域中熟習此項技術者在閱讀本發明之後將顯而易知，本文中所描述及說明之個別實施例中之每一者具有離散組分及特徵，其可容易地與其他若干實施例中之任一者之特徵分離或與其組合，而不脫離本發明技術之範疇或精神。
分子治療: 疫苗超級英雄漫畫
一種自幹細胞活體外分化之星狀細胞，該星狀細胞表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該星狀細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 一種自幹細胞活體外分化之許旺細胞，該許旺細胞表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該許旺細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 一種自幹細胞活體外分化之寡樹突神經膠質細胞，該寡樹突神經膠質細胞表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該寡樹突神經膠質細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。
分子治療: 核酸医薬
短暫轉染之293細胞或桿狀病毒感染之Sf9細胞中產生之所得AAV病毒粒子藉由此項技術中已知之標準方法純化及分析。 為了獲得小於圖1中示出的FVIII載體之載體，自初始載體序列移除本文發明人咸信對於FVIII表現及/或活性或對於AAV病毒粒子產生不必要之DNA序列。 移除外來DNA序列，包括AAV2 5' ITR之AAV2病毒序列3'之53個鹼基、AAV2 3' ITR之AAV2病毒序列5'之46個鹼基及鄰接於密碼子優化FVIII SQ編碼區之11個鹼基。 亦產生具有SQ連接子之新穎密碼子優化、B域缺失FVIII編碼序列且引入至新穎重組AAV FVIII載體中。 長度為4970個鹼基之所得Proto 1載體以示意性形式顯示於圖2A中，且完整核苷酸序列闡述於SEQ ID NO：1中。
在特定實施例中，該移植包含將該神經細胞群注射至該患者中。 在許多實施例中，該神經細胞群在投與後在該患者中存活及/或發揮功能至少一個月、兩個月、三個月、四個月或更長時間。 在一些實施例中，在該患者經歷繼發於神經病症或病況之該患者之血腦障壁的後續破壞之後，該神經細胞群在該患者中維持長期功能。 在其他實施例中，該患者之血腦障壁之該後續破壞係歸因於感染或中風。 分子治療 在許多實施例中，該神經細胞群在該患者之血腦障壁之破壞後展現出長期存活。 分子治療 在多個實施例中，該神經細胞群在該患者之血腦障壁之該破壞後展現出長期功能。
分子治療: 接種疫苗
在一些實施例中，腦EC表徵為選自由以下組成之群組之一或多個特徵：緊密接合之高表現、高電阻、低開窗、小血管周空間、胰島素及運鐵蛋白受體之高流行率以及大量粒線體。 所有在加拿大使用的成人及兒童疫苗，都經過同樣的審批過程。 當您小孩到期接種下一劑疫苗時，我們將透過短訊或電郵發出另一個預約邀請。 你會在以下時間收到預約邀請在您的小孩第一次接種後大約56天，以接種第二劑。 1.8E13 vg/kg AAV5-FVIII-SQ之動物中，觀測到動物間變化性且僅動物子組具有可偵測血漿FVIII-SQ及活性水準。
分子治療: 免疫系統嚴重或中度受損兒童接種第三劑疫苗的資格
[圖6]描繪移植至健康同種異體BALB/c小鼠腦部之紋狀體中的dKO/CD47Tg(B2M-/-CIITA-/-CD47tg) EC的生物發光成像。 將小鼠iPSC衍生之內皮細胞移植至健康同種異體BALB/c小鼠之紋狀體中。 [圖4]描繪移植至健康同種異體BALB/c小鼠腦部之紋狀體中之野生型EC的生物發光成像。 當動物失去意識時，記錄其重量且將動物頭頂自眼睛高度刮毛至耳後。
分子治療: 疫苗安全
可用於蛋白生產的許多桿狀病毒菌株及變異體及對應容許的昆蟲宿主細胞描述於Luckow等人、Miller等人；Maeda等人及McKenna中。 為了產生AAV Proto 7載體，FVIII內含子之34個鹼基藉由Proto 5載體中呈反向之34鹼基人類ApoE/C1增強子之第二複本置換。 Proto 7之序列之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO：8中。 為了產生AAV Proto 6載體，FVIII內含子之34個鹼基藉由Proto 5載體中呈正向之34鹼基人類ApoE/C1增強子之第二複本置換。 Proto 6之序列之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO：7中。 為了產生AAV載體Proto 2S，合成100鹼基內含子插入Proto 1S載體中之FVIII-SQ序列之外顯子1與2之間。
自分化第1天至第7天，亦向分化培養基中添加2 µM嘌嗎啡胺及100 ng/ml FGF8。 自分化第2天至第12天，將細胞在補充有3 µM CHIR99021之分化培養基中培養。 在同種異體小鼠(7隻小鼠中有7隻)中，在不使用任何免疫抑制之情況下，低免疫EC移植物穩定存活度過19天隨訪(圖6)。 將dKO/CD47Tg EC移植至健康同種異體BALB/c小鼠腦部之紋狀體中。 此類細胞亦存活於健康免疫功能不全SCID灰棕色小鼠中(圖7)。
為了調查FVIII表現，在流體動力學注射方案中測試某些本發明之重組AAV FVIII構築體以量測其在活體內導致功能FVIII蛋白表現之能力。 如圖6中所示，在5μg質體劑量下測試之所有構築體以改變效率水準產生功能FVIII。 桿狀病毒為節肢動物之包封DNA病毒，其兩個成員為用於在細胞培養物中產生重組蛋白之熟知表現載體。 桿狀病毒具有環狀雙鏈基因組(80-200kbp)，其可經工程改造以允許將大基因組內含物傳遞至特定細胞。
